利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)篩選upr小分子調(diào)控劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)與運(yùn)用領(lǐng)域，具體涉及一種利用雙熒光 素酶報(bào)告基因系統(tǒng)篩選非折疊蛋白反應(yīng)小分子調(diào)控劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)境脅迫會(huì)干擾真核生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊過(guò)程，造成未折疊的蛋白或 錯(cuò)誤折疊的蛋白大量滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[(endoplasmic reticulum stress, ER) - stress]，影響真核細(xì)胞的正常的生理過(guò)程。為緩解ER-stress，真核細(xì)胞 會(huì)活化非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解 (ER-associated degradation，ERAD)通路和1?離子通路。
[0003] UPR在這一系列反應(yīng)中處于核心地位。UPR包含[(inositol-requiring enzyme-1)-(X_box binding protein 1)，I RE I-XBPI]通路、[protein kinase RNA(PKR)-Iike ER kinase-eIF2a，PERK_eIF2a]通路及 activating transcription factor 6 (ATF6)通路這3條支路。Bip基因則是UPR活性狀態(tài)的一個(gè)指示分子，其表達(dá)量 上調(diào)是UPR被激活的表現(xiàn)。
[0004] 除了對(duì)抗環(huán)境脅迫之外，UPR也參與眾多的細(xì)胞過(guò)程，最重要的是參與先天性免疫 系統(tǒng)，尤其是TLR/MD-NF- κ B通路的調(diào)控。在UPR與炎癥反應(yīng)的關(guān)系方面，先前的研宄表 明其促進(jìn)炎癥反應(yīng)相關(guān)的NF- κ B因子活化，而新的研宄結(jié)果表明這一促進(jìn)作用發(fā)生在炎 癥反應(yīng)初期，當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)展到一定的程度后則反之。如在人系膜細(xì)胞中，當(dāng)腎小球炎癥 反應(yīng)持續(xù)發(fā)生時(shí)，細(xì)胞因子通過(guò)PERK和IREl通路，選擇性上調(diào)C/ΕΒΡ-β表達(dá)，過(guò)量表達(dá) 的C/ΕΒΡ-β抑制NF- κ B因子活性，從而一定程度減輕腎小球炎癥反應(yīng)。另有研宄發(fā)現(xiàn)在 ER-stress發(fā)生時(shí)，小鼠 TNFR-IKK/NF- κ B通路（與果蠅MD通路類似）的IKK復(fù)合物體 活性雖未顯著增強(qiáng)，但其本底活性對(duì)于ER-stress引起的NF- κ B活化的程度有決定作用， 而IREl能夠通過(guò)其激酶活性維持IKK復(fù)合物的本底活性。IREl還可通過(guò)自磷酸化而激活 TNF 受體相關(guān)因子 2 (TNF receptor-associated factor 2, TRAF2)，再由 TRAF2 引發(fā)級(jí)聯(lián)反 應(yīng)使I κ B發(fā)生磷酸化而釋放NF- κ B因子，繼而啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。也有研宄表明UPR 的ATF6支路可能通過(guò)AKT31參與NF- κ B的調(diào)控。UPR在發(fā)育、細(xì)胞凋亡、物質(zhì)代謝和細(xì)胞 周期調(diào)控方面也均有重要功能。
[0005] 因?yàn)閁PR參與了細(xì)胞如此多的過(guò)程，所以一旦其出現(xiàn)異常，往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾 病的發(fā)生，如帕金森癥、糖尿病、視網(wǎng)膜炎、遺傳性包涵體肌病和囊胞性纖維癥等。
[0006] 對(duì)于UPR功能的研宄者而言，一方面為了更加全面地理解UPR的功能、細(xì)胞的信號(hào) 傳遞、控制細(xì)胞命運(yùn)等過(guò)程，抑制劑與激活劑是至關(guān)重要的研宄工具；另一方面，研發(fā)治療 UPR相關(guān)的疾病相的藥物治療需要篩選UPR調(diào)控劑的平臺(tái)。因此UPR小分子調(diào)控劑篩選系 統(tǒng)方法的建立有積極的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的提供一種能夠高效、特異性地篩選UPR小分子調(diào)控劑的方法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：
[0009] -種利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)篩選UPR(非折疊蛋白反應(yīng)）小分子調(diào)控劑的 方法，其包括如下步驟：
[0010] (1)根據(jù)凡納濱對(duì)蝦Bip基因的啟動(dòng)子序列，構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體；
[0011] (2)用所述報(bào)告基因載體和內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；
[0012] (3)轉(zhuǎn)染40小時(shí)后，加入U(xiǎn)PR小分子調(diào)控劑，8小時(shí)后，裂解細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞裂解液 的螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性比值，與未加入U(xiǎn)PR小分子調(diào)控劑的對(duì)照組相 比較，檢測(cè)其對(duì)UPR的調(diào)控效果；
[0013] 作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟（1)中，構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體的方 法為：設(shè)計(jì)一對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的LvBip啟動(dòng)子擴(kuò)增引物的特異性引物，其序列如下：
[0014] pGL3LvBip-Sac I -F:5' -TATGAGCTCAGGCGGTCAAATGAATAGGTAA-3' ；
[0015] pGL3LvBip-Bgl II -R :5' - AATAGATCTCAGCGATTGCTGCTAATGC-3'，
[0016] 以凡納濱對(duì)蝦基因組為模板擴(kuò)增LvBip長(zhǎng)度為1285bp的啟動(dòng)子序列，利用引物中 帶入的Sac I和Bgl II酶切位點(diǎn)將其連入pGL3Basic載體，構(gòu)建成pGL3LvBip報(bào)告基因載 體。
[0017] 更優(yōu)選地，所述步驟（1)中，50 μ L PCR反應(yīng)體系加樣參數(shù)：正反引物各1 μ L，IOmM dNTPlyL，10XPCR buffer 5yL，LA Taq酶lyL，凡納濱對(duì)蝦基因組模板200ng，以超純水 補(bǔ)足至50yL ;PCR運(yùn)行程序參數(shù)：94°C預(yù)變性3分鐘；然后94°C變性30秒，58°C退火30秒， 72 °C延伸1分子；重復(fù)循環(huán)34次。
[0018] 更優(yōu)選地，所述步驟（1)中，將PCR產(chǎn)物膠回收純化之后，利用限制性內(nèi)切酶 Sac I和Bgl II分別切割PCR產(chǎn)物和pGL3Basic空載體各1 μ g。
[0019] 更優(yōu)選地，50yL的酶切體系為：10X酶切緩沖液體5yL，兩種限制性內(nèi)切酶各 5 μ L，DNA 1 μ g，加純水補(bǔ)足50 μ L，酶切溫度37°C，酶切時(shí)間2小時(shí)。
[0020] 更優(yōu)選地，所述步驟（1)中空載體和PCR片段酶切完成之后，進(jìn)行克隆、測(cè)序，確定 載體成功構(gòu)建；提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒、測(cè)濃度，保存待用。
[0021] 作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟（2)中，以96孔板每孔0. 2 μ g pGL3LvBip報(bào) 告基因質(zhì)粒和0. 02 μ g pRL-ΤΚ內(nèi)參質(zhì)粒的量共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。
[0022] 更優(yōu)選地，所述步驟（2)中，96孔板的每孔的轉(zhuǎn)染體系中，50 yL含有pGL3LvBip 0.2 μ g，pRL-TK 0.02 μ g，轉(zhuǎn)染試劑為 Iipofectamine 2000。
[0023] 更優(yōu)選地，所述步驟（2)中，提前一天于96孔板中培養(yǎng)293T細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至覆 蓋90%的面積進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。
[0024] 作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟（3)中，加入U(xiǎn)PR小分子調(diào)控劑的濃度為 20 ?80 μ mol/L。
[0025] UPR小分子調(diào)控劑對(duì)于UPR的功能研宄及UPR引起的疾病的治療有重要作用。本 發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0026] (1)本發(fā)明的方法利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)半自動(dòng)化、可簡(jiǎn)便、高通 量的對(duì)候選的UPR調(diào)控小分子進(jìn)行大規(guī)模的篩選；
[0027] (2)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的合理設(shè)計(jì)減少了由于實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程、轉(zhuǎn)染效率和 細(xì)胞狀態(tài)差異引起的實(shí)驗(yàn)誤差，使得準(zhǔn)確準(zhǔn)確性更高；
[0028] (3)本發(fā)明主要運(yùn)用于UPR功能研宄的小分子調(diào)控劑的篩選，也用于輔助UPR相關(guān) 疾病治療藥物的篩選；
[0029] (4) Bip基因的啟動(dòng)子中UPR相關(guān)的調(diào)控元件在真核細(xì)胞中具有通用性，因?yàn)樗?的LvBip啟動(dòng)子序列構(gòu)建的報(bào)告基因載體在不同的真核細(xì)胞中均有效，所篩選到的UPR活 性調(diào)控劑小分子亦在真核細(xì)胞中有通用性。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是pGL3LvBip報(bào)告基因載體構(gòu)建示意圖。其中，（A)pGL3Basic質(zhì)粒圖片；(B) LvBip啟動(dòng)子序列插入pGL3Basic的多克隆位點(diǎn)的Sac I和Bgl II位點(diǎn)之間。
[0031] 圖 2 是 Tunicamycin (UPR激活劑）、Salubrinal (UPR抑制劑）和姜黃素（Curcumin) 對(duì)pGL3LvBip報(bào)告基因載體的調(diào)控作用示意圖。其中，293T細(xì)胞孵育含Tunicamycin、 Salubrina和Curcumin培養(yǎng)基之后細(xì)胞裂解液中螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性 比值發(fā)生顯著變化。通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)孵育普通培養(yǎng)基+衣霉素的細(xì)胞或孵育普 通培養(yǎng)基+姜黃素的細(xì)胞的裂解液中螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性比值與對(duì)照 組相比顯著升高；孵育