一種海洋微藻的串聯(lián)培養(yǎng)和快速收集方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及一種海洋微藻的串聯(lián)培養(yǎng)和快速收集方法。
【背景技術(shù)】
[0002]本發(fā)明公開了亞心形扁藻和球等鞭金藻混合串聯(lián)培養(yǎng)和快速收集方法。亞心形扁藻Platymonas subcordiformis是一種海洋單細胞微藻，大量出現(xiàn)在沿海池沼和風(fēng)浪平靜的港灣，隸屬綠藻門、綠藻綱、團藻目、衣藻科。藻體扁壓，細胞前面觀呈廣卵形，前端較寬闊，中間有一淺的凹陷，鞭毛4條，由凹處伸出。細胞內(nèi)有一大型杯狀綠色色素體。藻體后端有一蛋白核，核附近有一紅色眼點。長11-16微米，寬7-9微米，厚3.5-5微米。無性繁殖，當(dāng)環(huán)境不良時形成休眠孢子，橢圓形，一或兩個，沒發(fā)現(xiàn)有性生殖。鹽度適應(yīng)范圍廣，為8-80%。，最適30-40%。。對溫度適應(yīng)范圍也很廣，7°C _30°C均能生長繁殖，最適20°C -28°C,33°C以上生長繁殖受抑制，出現(xiàn)黃萎，35°C大量死亡，故南方夏季培養(yǎng)較困難。光度強度1000-200001ux能生長繁殖，最適光強5000-100001ux。在最適光強下，表現(xiàn)趨光性。適應(yīng)pH值6-9，最適7.5-8.5。該藻適應(yīng)能力強，生長繁殖迅速，易培養(yǎng)，是許多貝類如扇貝、貽貝、毛蚶、魁蚶、縊蟶幼體(特別是后期幼體)良好餌料。若和等鞭金藻配合使用，能取得更好育苗效果。用來飼喂動物性餌料輪蟲、裸腹蚤、豐年蟲也有良好營養(yǎng)強化作用。
[0003]球等鞭金藻Isochrysis galbana Parke分類上屬金藻門Chrysophyta，金藻綱Chrysophyceae,等鞭金藻目Isochrysidales，等鞭金藻科Isochrysidaceae，等鞭金藻屬Isochrysis Parke，是一種無壁單細胞微藻，營光合自養(yǎng)生活，胞內(nèi)脂肪酸含量高。細胞裸露，形狀多變，多橢圓形，幼細胞背腹面略扁平，側(cè)面觀為長橢圓或長方形。細胞前端生出兩條等長尾鞭型鞭毛，鞭毛平滑，長度為細胞1-2倍。鞭毛基部有液泡。胞內(nèi)具2個大而伸長側(cè)生色素體，形狀和位置隨體形而變。一暗紅色、卵圓形眼點位于細胞中央，偶有靠近前端。細胞核一個，常位于細胞中間。貯藏物是油滴和白糖素，油滴分布在胞質(zhì)，白糖素位于細胞后端，為2-5個小塊。細胞長4.4-7.1微米，寬2.7-4.4微米，厚2.4-3微米，行二分裂繁殖。適應(yīng)鹽度范圍14-40%。，最適30%。，最適溫度20-25°C，最適光照1500_60001ux，適宜pH 8左右。該藻無胞壁，大小適口，營養(yǎng)豐富，易被動物幼蟲消化吸收，已廣泛用于飼喂貽貝、牡蠣、泥蚶等，被認為是海產(chǎn)雙殼類動物幼蟲的理想餌料。
[0004]目前，亞心形扁藻規(guī)模化培養(yǎng)存在的主要問題是藻細胞生長緩慢、倍增時間長。關(guān)于海洋微藻的培養(yǎng)方法，過去張衛(wèi)曾公開了一種亞心形扁藻高密度培養(yǎng)與產(chǎn)氫一體化的制氫方法(申請?zhí)朇N200810229976)。該發(fā)明微藻產(chǎn)氫是將低密度微藻接種于反應(yīng)器中，利用富加二氧化碳培養(yǎng)方式，經(jīng)短期培養(yǎng)即可達到產(chǎn)氫所需的生物量，然后再經(jīng)暗誘導(dǎo)，即可進入連續(xù)光照產(chǎn)氫階段。該發(fā)明首次將微藻培養(yǎng)和產(chǎn)氫兩段工藝相結(jié)合并利用燃料電池將氫轉(zhuǎn)化為電能，為規(guī)?；⒃瀹a(chǎn)氫提供了可靠技術(shù)支持。但該法基建投資大，工藝繁雜，技術(shù)要求高，普通工人難以掌握。韓笑天公開了一種海洋微藻及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用(申請?zhí)朇N201010515598)，海洋微藻為球等鞭金藻(Isochrysis sp.CCMM5001)，于 2010 年 6 月 7 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC M2010138。其培養(yǎng)方法為分離出金藻單個藻細胞，獲得的純種細胞于實驗室條件下進行擴大培養(yǎng)；待球等鞭金藻生長的平臺期后第四天離心、干燥即得到藻粉。所述球等鞭金藻可作為生物柴油的原料。微藻的培養(yǎng)是利用工業(yè)廢氣中的二氧化碳，緩解溫室氣體排放，也可吸收工業(yè)廢氣中氮氧化合物，減少環(huán)境污染，但該藻株抗逆性差，不耐低溫，鹽度適應(yīng)范圍狹窄，難以大規(guī)模推廣。楊海麟發(fā)明了一種自養(yǎng)產(chǎn)油微藻的高密度培養(yǎng)工藝(申請?zhí)朇N201010509643)，采用分割法與二步法相耦合的發(fā)酵方法，以火電廠排放的CO2廢氣為碳源，以過濾除雜菌或雜藻后的市政污水作為培養(yǎng)基，高密度培養(yǎng)產(chǎn)油微藻，較佳地，在市政污水中添加海鹽模擬海水，使其滲透壓增大防止雜菌或雜藻污染，產(chǎn)油微藻選自小球藻、微擬球藻、布朗葡萄藻、纖細角毛藻、海綠球藻、球等鞭金藻、新月菱形藻、三角褐指藻、杜氏藻和菱形藻的一種或幾種，該發(fā)明能實現(xiàn)氮、磷及CO2高去除效率且藻濃度、油脂及蛋白含量高，達到保護環(huán)境和生產(chǎn)生物資源雙重效果，成本低，無污染，綜合效益高，但該法工藝流程長，操作麻煩，費時費力，效率低下。傳統(tǒng)上收集藻細胞有物理和化學(xué)兩種方法，物理方法包括離心法、重力沉降法、遮光法、降溫法、超聲波沉降法、電流沉淀法；化學(xué)濃縮法即使用明礬、氫氧化鈉、高錳酸鉀等試劑沉淀濃縮，常用試劑是明礬。這些收集方法或者耗電多，耗資巨大，或者沉淀效果差，沉淀時間長且沉淀不徹底。
[0005]為了克服傳統(tǒng)技術(shù)的不足，本發(fā)明公開了一種海洋微藻的串聯(lián)培養(yǎng)和快速收集方法。本技術(shù)的創(chuàng)造性和新穎性表現(xiàn)在:I)摒棄傳統(tǒng)的海洋微藻單種養(yǎng)殖的做法，采用對環(huán)境因素要求相近的兩種微藻-亞心形扁藻和球等鞭金藻混合養(yǎng)殖，優(yōu)勢互補，相互促進，充分利用營養(yǎng)鹽和光譜，減少了資源浪費；2)采用三個三角燒瓶串聯(lián)養(yǎng)殖，通入的氣體得到三次利用，節(jié)約了能量和資源，且三角燒瓶透光性好，洗刷方便，操作容易，易于觀察，不易污染；3)尊重藻細胞的生長規(guī)律，根據(jù)藻類不同生長階段對環(huán)境條件的特定要求，在培養(yǎng)的早、中、晚期提供不同的光照強度、光照時間和溫度，早期給予較低的光照強度和溫度，避免強光對微藻的光傷害，有利于生長，晚期提供較高的光照和溫度，有利于細胞中EPA、DHA等高不飽和脂肪酸大量積累；4)培養(yǎng)液成分的改革。在傳統(tǒng)的f/2培養(yǎng)液基礎(chǔ)上補充了NaHCO3, NH4NO3,尿素，人尿，Na2S13,牛糞浸出液，磷酸媽，土壤浸出液，海泥抽取液，NiS14,NH4VO3, Co (NO3) 2，Na2WO2等營養(yǎng)鹽，營養(yǎng)更全面均衡，有利于細胞快速生長；5)微藻收集方法的創(chuàng)新。本發(fā)明將培養(yǎng)后的藻液加入復(fù)合沉淀劑后，將藻液置于5°C低溫且黑暗環(huán)境，由于沉淀劑的絮凝作用和溫度、光照的大幅降低，藻細胞迅速休克，繼而沉淀，收集速度快且沉淀徹底，細胞不破碎，營養(yǎng)成分散失少，花錢少，操作簡單，實用性強。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種海洋微藻的串聯(lián)培養(yǎng)和快速收集方法，具體方法如下:
[0007]步驟I培養(yǎng)液的制備
[0008]培養(yǎng)液成分配方！NaHCO3I份，NH4NO30.2份，尿素0.1份，人尿0.5份，Na2S130.005份，f/2微量元素溶液I份，f/2維生素溶液I份，磷酸鈣0.2份，牛糞浸出液I份，土壤浸出液 0.8 份，海泥抽取液 0.5 份，NiS14.6H20 0.02 份，NH4VO30.001 份，Co (NO3) 2.6Η200.05份，Na2WO2.2Η20 0.03份，煮沸冷卻海水1000份；裝入棕色磨口塞試劑瓶中，密封，放在搖床上搖勻15分鐘，置入4°C冰箱保存，備用；其中f/2微量元素溶液配方(按配制1000毫升溶液計):ZnSO4.4Η20 23 毫克，MnCl2.4Η20 178 毫克，CuSO4.5Η20 10 毫克，F(xiàn)eC6H5O7.5Η203.9克，Na2MoO4.2Η20 7.3 毫克，CoCl2.6Η20 12 毫克，Na2EDTA 4.35 克，純水 1000 毫升；f/2 維生素溶液配方(按配制1000毫升溶液計):維生素B120.5毫克，維生素B110毫克，維生素H 0.5暈克，純水1000暈升。
[0009]步驟2接種培養(yǎng)
[0010]取三個5000毫升潔凈三角燒瓶，加入步驟I所述培養(yǎng)液2500毫升，選生長旺盛、無污染、處于指數(shù)生長期的亞心形扁藻和球等鞭金藻藻種分別接種，接種密度亞心形扁藻2.5萬個細胞/毫升藻液，球等鞭金藻8萬個細胞/毫升藻液，輕輕搖勻3分鐘。用橡皮塞塞住瓶口，塞子上打上2個孔，孔的直徑為9毫米，插入兩根玻璃管，管的直徑為8毫米，一根為充氣管，另一根為排氣管，第2個瓶的充氣管與第一個瓶的排氣管相連，第3個瓶的充氣管與第2個瓶的排氣管相連，這樣充入的氣體依次經(jīng)過三個瓶子，可得到3次利用。第一個桶的充氣管上端連接空氣壓縮機，另一端插入到藻液底部，充入混合氣體，氣體成分=空氣98% +純CO2L 5% + —氧化氮0.3% +硫化氫0.2%，每天24小時不間斷充氣，氣量不宜太大，以藻細胞浮起不下沉即可；將這3個三角燒瓶放入微藻培養(yǎng)室中培養(yǎng)，室內(nèi)空調(diào)控溫，日光燈管照明，以打開燈管的數(shù)量多少來控制光照強度，連續(xù)培養(yǎng)9天，前3天調(diào)節(jié)溫度至22°C，光照強度45001UX，光暗周期=6h/L+6h/D，即提供間歇光，6小時連續(xù)光照，6小時連續(xù)黑暗，如此循環(huán)；第4-6天，調(diào)節(jié)溫度至24°C，光照強度60001uX，每天提供15小時連續(xù)光照，然后9小時連續(xù)黑暗，如此循環(huán)，至第7天，調(diào)節(jié)溫度至26°C，光照強度SOOOlux，每天24小時連續(xù)光照，沒有黑暗，每個瓶子補加蒸餾水500毫升。到第9天，亞心形扁藻細胞密度可達600萬/毫升藻液，球等鞭金藻藻細胞密度可達到1800萬/毫升藻液，即可收集；
[0011]步驟3藻細胞收集
[0012]取硫酸亞鐵，甲殼素，氯化鋁各1000g，分別用粉碎機粉碎至面粉狀(粒徑大小以通過200目篩絹為宜)，按硫酸亞鐵I份，甲殼素3份，氯化鋁2份的比例混合，用攪拌機充分攪拌、混合均勻，制成復(fù)合沉淀劑，取培養(yǎng)了 9天的藻液1000份，加入所述復(fù)合沉淀劑0.4份，用空氣壓縮機連接一塑料管插入藻液充氣攪拌、混合15分鐘，將藻液置于5°C冷柜中(保持黑暗)靜置、沉淀24小時，由于沉淀劑的沉淀和溫度的突然降低，藻細胞迅速休克且下沉到瓶底，棄上清液，取底部粘稠牙膏狀藻泥，藻細胞收集完畢。
[0013]有益結(jié)果
[0014]傳統(tǒng)上，海洋微藻常采用光生物反應(yīng)器或開放水泥池培養(yǎng)，基建投資大，工藝繁雜，技術(shù)要求高，普通工人難以掌握，成本高，易污染，操作麻煩，費時費力，效率低下。為了克服傳統(tǒng)技術(shù)的不足，本發(fā)明公開了一種海洋微藻的串聯(lián)培養(yǎng)和快速收集方法。本技術(shù)的創(chuàng)造性和新穎性表現(xiàn)在:1)摒棄傳統(tǒng)的海洋微藻單種養(yǎng)殖的做法，采用對環(huán)境因素要求相近的兩種微藻-亞心形扁藻和球等鞭金藻混合養(yǎng)殖，優(yōu)勢互補，相互促進，充分利用營養(yǎng)鹽和光譜，減少了資源浪費；2)采用三個三角燒瓶串聯(lián)養(yǎng)殖，通入的氣體得到三次利用，節(jié)約了能量和資源，且三角燒瓶透光性好，洗刷方便，操作容易，易于觀察，不易污染；3)尊重藻細胞的生長規(guī)律，根據(jù)藻類不同生長階段對生態(tài)條件的特定要求，在培養(yǎng)的早、中、晚期提供不同的光照強度、光照時間和溫度，早期給予較低的光照強度和溫度，避免強光對微藻的光傷害，有利于生長，晚期提供較高的光照和溫度，促進了細胞中EPA、DHA等高不飽和脂肪酸的大量積累；4)培養(yǎng)液成分的改革。在原來的f/2培養(yǎng)液基礎(chǔ)上補充了 NaHCO3,NH4NO3,尿素，人尿，Na2S13,牛糞浸出液，磷酸媽，土壤浸出液，海泥抽取液，Ni