一種精氨酸雙糖苷的合成方法及其在抗衰老中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種精氨酸雙糖苷(AFG)的合成方法及其在抗衰老方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 精氨酸雙糖苷（AFG)是人參炮制過程中，鮮人參在烘干階段麥芽糖與精氨酸發(fā)生 羰醛縮和反應(yīng)經(jīng)Amadori重排生成。研究發(fā)現(xiàn)AFG不僅具有促進微循環(huán)[1]、擴張血管[2]和治 療糖尿病 [3]等藥理活性，還可促進皮膚膠原蛋白合成而提高皮膚彈性[4]。文獻中記載AFG 合成途徑為[5]:無水冰乙酸環(huán)境下，精氨酸和麥芽糖質(zhì)量比為1:2，80°C反應(yīng)0.5h~1.0h， 合成率約為27%，且粗合成物具有強烈刺激性酸味，因此，有必要尋找一種合成率高、無刺激 性氣味的合成方法。
[0003] 伴隨著世界老齡化趨勢的發(fā)展和工作生活壓力的增大，疾病性衰老和亞健康性衰 老也日趨明顯。除基因片段缺失和突變^外，氧化應(yīng)激損傷 [8'9'1(1]是導致衰老的最主要的 原因。本實驗探討AFG對D-半乳糖致小鼠亞急性衰老的抑制作用，根據(jù)AFG在大鼠體內(nèi)的 藥代動力學[11]可知，AFG在機體內(nèi)的主要代謝部位為肝臟，也可通過血腦屏障作用于大腦， 因此依據(jù)衰老小鼠機體生化指標變化，通過檢測AFG給藥組小鼠肝臟和腦組織中抗氧化能 力的改變來判斷其對衰老小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的修復能力。
[0004] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
AFG合成方法：精氨酸和麥芽糖以無水熱穩(wěn)定溶劑為反應(yīng)媒介，固體有機酸為催化劑， 加熱和混勻條件下生成精氨酸雙糖苷(AFG)。
[0005] 本發(fā)明對D-半乳糖致小鼠亞急性衰老模型造模部位及其最佳造模劑量進行優(yōu) 化，得出：D-半乳糖致小鼠亞急性衰老模型造模時頸背部皮下注射法（SC)優(yōu)于腹腔注射法 (IP)，且其最佳造模劑量分別為0. 5g/kg和2. 5g/kg。
[0006] 通過體內(nèi)實驗揭示AFG(50mg/kg)，可顯著提高衰老小鼠的腦指數(shù)、腦組織總抗氧 化能力和皮膚中羥脯氨酸含量，顯著降低了腦組織中丙二醛和一氧化氮含量，有效治療衰 老； 通過體內(nèi)實驗揭示AFG(30mg/kg)預(yù)防給藥可減緩小鼠衰老癥狀，提高小鼠胸腺指數(shù)、 皮膚中羥脯氨酸含量、血清中超氧化物歧化酶水平、腦組織總抗氧化能力和肝臟中過氧化 氫酶水平，能有效預(yù)防衰老。
[0007] 本發(fā)明的積極效果在于： 本發(fā)明中AFG的合成方法，合成率有大幅提高，可達79%，同時降低了AFG的生產(chǎn)成本， 且粗合成物無刺激性氣味，合成所用酸性物質(zhì)為常用食品添加劑，丙三醇亦為食品和化妝 品添加劑，對人體均無毒無刺激性，增加了AFG粗合成物的使用安全性，合成率的提高加快 了AFG走向工業(yè)化的步伐。
[0008] 本發(fā)明經(jīng)過預(yù)實驗探討出D-半乳糖致小鼠亞急性衰老最佳造模部位及其最佳造 模劑量，提高了研究抗衰藥物的科學性揭示出AFG具有提高機體總抗氧化能力，顯著修復 機體的氧化應(yīng)激損傷，提高衰老機體腦指數(shù)和胸腺指數(shù)，提高皮膚彈性，整體表現(xiàn)抗衰老作 用。
[0009] 實驗例一AFG的合成與檢測 I.AFG的合成 1. 1精確稱量I.Og精氨酸、2.Og麥芽糖和0. 75g檸檬酸，置于20ml無水丙三醇中，混 勻條件下加熱至85°C，反應(yīng)2. 5h~3.Oh后冷卻，稀釋后檢測粗合成中AFG濃度。
[0010] 1. 2精確稱量反應(yīng)底物（I.Og精氨酸+2.Og麥芽糖）4份，均放于20ml丙三醇中， 依次加入I. 5g、I. 0g、0. 75g和0? 5g檸檬酸，加熱至85°C，反應(yīng)2. 5h后冷卻。粗合成物稀釋 后檢測AFG濃度。
[0011] 1. 3精確稱量反應(yīng)底物（I.Og精氨酸+2.Og麥芽糖)加入檸檬酸0. 5g，混勻加熱至 85 °C反應(yīng)2. 5h冷卻，粗合成物稀釋后檢測AFG合成率變化。
[0012] L4設(shè)定空白對照組：0? 75g檸檬酸與20ml丙三醇85°C反應(yīng)2. 5h。
[0013] 1. 5其它固體有機酸(蘋果酸，苯甲酸和草酸等)催化AFG合成反應(yīng)，方法同本專利 1. 1。
[0014] 2.AFG粗合成物的檢測 運用柱前衍生高效液相色譜法[5]，以空白組(丙三醇20ml+檸檬酸0. 75g，85°C反應(yīng) 2. 5h)和AFG標品為空白和對照，檢測和計算粗合成物中AFG的生成率。） 色譜條件：Venusil-AA氨基酸分析專用柱（5 6mmX250mm)。流動相 A:乙酸鈉緩沖溶液一乙腈溶液（pH=6. 5);流動相B:乙腈水溶液V(乙腈）：V( 水）=4 : 1。0min，0%B; 4min，3%B; 16min，10%B; 17min，20%B; 32min，34%B; 34min, 100%B; 38min,0%B梯度洗脫；流速I. 0mL/min;檢測波長 254nm;柱溫 40°C;進樣量 20iiL。
[0015] 結(jié)果 如附圖1、2所示，AFG標品和AFG+ARG混標比較可以看出，AFG的保留時間在混標里沒 有發(fā)生變化，可以確定AFG和ARG在此檢測條件下的保留時間分別為5. 9min和14. 3min。 如附圖圖3所示，空白對照組在AFG和ARG保留時間內(nèi)無出峰現(xiàn)象，說明甘油和檸檬酸(苯 甲酸、蘋果酸和草酸等）在85°C加熱條件下不會產(chǎn)生干擾AFG與ARG測定的物質(zhì)。
[0016]如附圖4所示：本專利方法合成物中含有AFG，且粗合成物被稀釋后AFG可被直接 檢測。說明在檸檬酸、甘油和加熱條件下精氨酸和麥芽糖發(fā)生美拉德反應(yīng)生成精氨酸雙糖 苷（AFG)。此合成方法可行、高效，合成率可達72. 45%。
[0017] 如附圖5~8所示，和檸檬酸粗合成物比較可以看出，在同等實驗條件下蘋果酸、苯 甲酸、草酸和丁二酸同樣可催化精氨酸麥芽糖反應(yīng)生成精氨酸雙糖苷(AFG)。由此可以判 斷，在熱穩(wěn)定溶劑中加熱呈現(xiàn)酸性的固體有機酸均可催化美拉德反應(yīng)。
[0018] 實例二D-半乳糖致小鼠亞急性衰老造模部位的比較及相應(yīng)劑量的篩選 1實驗動物 SPF級ICR6小鼠80只，2月齡，購自吉林大學白求恩醫(yī)學院實驗動物中心，許可證號 為SCXK-(吉）2013-0003。飼養(yǎng)條件：溫度23±2°C，濕度55±5%，所用飼料為普通型。
[0019] 實驗方法 2. 1分組及給藥(如表1所示） 表1各組分組及給藥情況
【主權(quán)項】
1. 精氨酸雙糖苷（AFG)合成方法：精氨酸、麥芽糖和酸性物質(zhì)在無水熱穩(wěn)定溶劑中，混 勻加熱生成精氨酸雙糖苷。具體方法：精氨酸和麥芽糖一定比例在無水熱穩(wěn)定溶劑中，加入 酸性物質(zhì)〇. Ig?I. 5g，2(TC?10(TC加熱IOmin?200min，生成精氨酸雙糖苷。 2. D-半乳糖致小鼠亞急性衰老模型的最佳造模部位及其最佳劑量：頸背部皮下注射 D-半乳糖500mg/kg8周，腹腔注射D-半乳糖的最佳造模劑量為2. 5g/kg8周。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述精氨酸雙糖苷對衰老有治療作用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述精氨酸雙糖苷對衰老有預(yù)防作用。
5. 精氨酸雙糖苷在提高機體胸腺指數(shù)、腦指數(shù)和抗氧化能力，修復氧化應(yīng)激損傷，可應(yīng) 用于抗衰老方面的食品、保健品及藥品。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種精氨酸雙糖苷(AFG)人工合成方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。即精氨酸與麥芽糖在熱穩(wěn)定溶劑中加入固體酸性物質(zhì)，加熱20℃-100℃發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成精氨酸雙糖苷(AFG)。本發(fā)明揭示了腹腔注射D-半乳糖(2.5g/kg)和皮下注射D-半乳糖(500mg/kg)8周致小鼠顯著性衰老，可分別作為腹腔注射和皮下注射造模的最佳劑量。衰老小鼠經(jīng)口灌入AFG處理：AFG50mg/kg可顯著提高衰老小鼠腦指數(shù)、腦組織總抗氧化能力和皮膚羥脯氨酸含量等，可效治療小鼠衰老；AFG30mg/kg預(yù)防給藥能顯著提高小鼠胸腺指數(shù)、皮膚中羥脯氨酸含量和血清中超氧化物歧化酶水平等，可預(yù)防小鼠衰老。AFG能提高衰老機體總抗氧化能力，并修復氧化應(yīng)激損傷，具有抗衰老作用，可用于制備抗衰老藥物。
【IPC分類】C07H5-04, C07H1-00, A23L1-30, A61K31-7016, A61P39-06
【公開號】CN104610384
【申請?zhí)枴緾N201410637060
【發(fā)明人】孫榮花, 鄭毅男, 邵瑩, 李偉, 丁傳波, 李慧萍, 宋明銘, 王佳琦
【申請人】鄭毅男
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年11月11日