一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)l-多巴黑色素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物及其應(yīng)用領(lǐng)域，特別是涉及一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色 素的方法，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)的L-多巴黑色素的理化性質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002] 天然黑色素在動、植物及微生物中均可產(chǎn)生。而動、植物材料生長繁殖受季節(jié)、氣 候、產(chǎn)地等因素的影響，提取的色素價(jià)格昂貴，應(yīng)用受到局限。微生物如放線菌、真菌和細(xì)菌 均可產(chǎn)黑色素。微生物所產(chǎn)黑色素一般是由體內(nèi)的酪氨酸酶催化酪氨酸形成L-多巴，再經(jīng) 一系列氧化過程而形成，屬于氨基酸的衍生物，且無毒、無害。
[0003] 酪氨酸酶（EC L 14. 18. 1，Tyrosinase)，又被稱為多酚氧化酶，是一種含銅的金屬 酶，主要參與L-多巴黑色素的合成過程：（1)催化L-酪氨酸羥基化轉(zhuǎn)變?yōu)長-多巴；（2)氧 化L-多巴形成多巴醌，多巴醌經(jīng)一系列反應(yīng)后形成L-多巴黑色素。酪氨酸酶在生物體中 具有重要的生理功能，是L-多巴黑色素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。L-多巴是一種重要的 生物活性物質(zhì)，可以通過血腦屏障，在腦組織中脫羧形成一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)--多巴胺。 因此L-多巴可研制成治療老年常見病--帕金森氏病以及其它疾病如肝昏迷、一氧化碳中 毒、心力衰竭等的良藥。
[0004] 放線菌是土壤中的優(yōu)勢菌群，除極少數(shù)致病菌外，大多數(shù)放線菌具有重要的生物 學(xué)意義。鏈霉菌是一種重要的次生代謝物產(chǎn)生菌種，利用鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色素， 具有周期短、成本低廉、生產(chǎn)工藝簡單，便于操作，適于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色素的方法，本發(fā)明采用 鏈霉菌（Streptomyces sp.)T2-10發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色素，還涉及所產(chǎn)L-多巴黑色素的 理化性質(zhì)。
[0006] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0007] -種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色素的方法，采用鏈霉菌（Streptomyces sp.) T2-10(CGMCC NO. 7449)菌株進(jìn)行生產(chǎn)。
[0008] 優(yōu)選的是，所述的鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色素的方法中，采用鏈霉菌 (Str印tomyces sp.)T2-10(CGMCC N0.7449)菌株進(jìn)行生產(chǎn)還包括如下步驟：
[0009] (1)種子液制備：
[0010] 取所述鏈霉菌T2-10菌株接種于液體培養(yǎng)基中，27-3rC，250-290rpm振蕩培養(yǎng) 24h制成種子液；
[0011] ⑵發(fā)酵培養(yǎng)：
[0012] 按1%接種量將所述種子液接種于所述液體培養(yǎng)基中，27_3rc，250-290rpm振蕩 培養(yǎng)72-96h制成發(fā)酵液；
[0013] (3) L-多巴黑色素的提取與純化：
[0014] 將所述發(fā)酵液于4°C下，SOOOrpm離心15min去掉菌體及其他不溶物后，發(fā)酵清液 采用大孔吸附樹脂分離純化，并用甲醇洗脫，50-60°C烘干后即得L-多巴黑色素結(jié)晶。
[0015] 優(yōu)選的是，所述的鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色素的方法中，所述液體培養(yǎng)基各組 分的質(zhì)量百分比為：燕麥粉1.0%，可溶性淀粉3.0%，豆柏粉0.3%，大米粉0.5%，葡萄糖 〇· 5%，酵母粉 0· 2%，酵母膏 0· 1%，KN03 0· 2%，Κ2ΗΡ040· l%，NaCl 0· l%，MgS04 0· 05%和 CaCO3 0· 3%。
[0016] 優(yōu)選的是，所述的鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色素的方法中，所述種子液和發(fā)酵液 的培養(yǎng)條件為29°C，260rpm振蕩培養(yǎng)。
[0017] 優(yōu)選的是，所述的鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色素的方法中，所述大孔吸附樹脂型 號為X-5,粒徑范圍0· 3?I. 25mm。
[0018] 優(yōu)選的是，所述的鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色素的方法中，所述烘干條件為60°C 烘4h。
[0019] 優(yōu)選的是，所述的鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色素的方法中，所述L-多巴黑色素 水溶解性和熱穩(wěn)定性較好且其中L-多巴含量較高。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：
[0021] 本發(fā)明提供一種生產(chǎn)L-多巴黑色素的方法，本發(fā)明使用鏈霉菌T2-10產(chǎn)L-多巴 黑色素，對該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵生產(chǎn)的L-多巴黑色素水溶解性和熱穩(wěn)定性較 好且其中L-多巴的含量較高；并且其生產(chǎn)工藝簡單，操作方便；鏈霉菌T2-10發(fā)酵生產(chǎn)的 L-多巴黑色素在食品、醫(yī)療和保健等方面具有重要的實(shí)用價(jià)值，并顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0022] 圖1為發(fā)酵溫度對產(chǎn)L-多巴黑色素的影響圖；
[0023] 圖2為轉(zhuǎn)速對產(chǎn)L-多巴黑色素的影響圖；
[0024] 圖3為本發(fā)明所述生產(chǎn)L-多巴黑色素的流程圖；
[0025] 圖4為本發(fā)明所述L-多巴黑色素 OD4citol值與質(zhì)量濃度的關(guān)系；
[0026] 圖5為本發(fā)明所述L-多巴標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0027] 圖6為本發(fā)明所述L-多巴黑色素的紫外-可見吸收光譜圖；
[0028] 圖7為本發(fā)明所述L-多巴黑色素的紅外光譜圖；
[0029] 圖8為本發(fā)明所述鏈霉菌T2-10發(fā)酵液中酪氨酸酶活性變化；
[0030] 圖9為本發(fā)明所述鏈霉菌T2-10發(fā)酵液中OD4citol值的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施 例。所述方法和試劑如無特別說明均為常規(guī)方法，所述原材料和設(shè)備如無特別說明均能從 公開商業(yè)途徑而得。
[0032] 本發(fā)明中用于生產(chǎn)L-多巴黑色素的鏈霉菌的分類命名為鏈霉菌（Streptomyces sp.)T2-10,該菌株屬于放線菌株，已于2013年4月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 7449。
[0033] 本發(fā)明所述生產(chǎn)L-多巴黑色素的方法：
[0034] 1材料與方法
[0035] I. 1液體培養(yǎng)基：燕麥粉10g，可溶性淀粉30g，豆柏粉3g，大米粉5g，葡萄糖5g， 酵母粉 2g，酵母膏 lg，KNO3 2g，K2HPO4 lg，NaCl lg，MgSO4O. 5g 和 CaCO3 3g，溶于蒸餾水中 定容至IOOOmL后，，調(diào)節(jié)pH為7，112°C滅菌20min后備用。
[0036] 1.2發(fā)酵條件確定：
[0037] 發(fā)酵的溫度和轉(zhuǎn)速會直接影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，因此需要尋找最適的產(chǎn)L-多巴 黑色素的條件。
[0038] 1.2.1發(fā)酵溫度篩選：
[0039] 將鏈霉菌T2-10菌株接種于裝有50mL液體培養(yǎng)基（pH 7. 0)的250mL三角瓶中，于 250印111，分別放入271：、281：、291：、301：、311：振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)9611后，離心取上清，測00_" 111 值。結(jié)果如圖1所示，溫度明顯影響黑色素的產(chǎn)出，29°C時(shí)，黑色素產(chǎn)量最大。因此，29°C是 本試驗(yàn)發(fā)酵產(chǎn)L-多巴黑色素的最適溫度，并且從圖1中也可以看出在27-31 °C范圍內(nèi)，所述 鏈霉菌T2-10都能發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色素。
[0040] 1.2.2發(fā)酵轉(zhuǎn)速篩選：
[0041] 將鏈霉菌T2-10菌株接種于裝有50mL液體培養(yǎng)基（pH 7. 0)的250mL三角瓶中， 分別于250rpm、260rpm、270rpm、280rpm、290rpm，29°C振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)96h后，離心取上清，測 00 4_"值。結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)速為260rpm時(shí)，產(chǎn)黑色素的濃度最大。因此，260rpm是本試 驗(yàn)發(fā)酵產(chǎn)L-多巴黑色素的最佳轉(zhuǎn)速，并且從圖2中也可以看出在250-290rpm范圍內(nèi)，所述 鏈霉菌T2-10都能發(fā)酵生產(chǎn)L-多巴黑色素。
[0042] 1. 3產(chǎn)L-多巴黑色素方法：
[0043] 如圖3所示，有如下步驟：
[0044] 1. 3. 1種子液制備：
[0045] 取鏈霉菌T2-10菌株接種于裝有50mL液體培養(yǎng)基（pH 7. 0)的250mL三角瓶中， 于260rp