一種檢測(cè)丙型副傷寒沙門氏菌的靶基因、pcr引物對(duì)、檢測(cè)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)丙型副傷寒沙門氏菌的 PCR引物對(duì)、特異性靶基因、利用該引物對(duì)和靶基因進(jìn)行檢測(cè)的方法以及包括引物對(duì)的試劑 盒和該引物對(duì)在檢測(cè)丙型副傷寒沙門氏菌試劑盒上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi C)是引起人類感染的主要沙門氏 菌血清型之一，此血清型菌株的主要宿主為人類。被感染者會(huì)出現(xiàn)不同程度的惡性、嘔吐、 腹瀉和發(fā)熱，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)敗血癥等。在最近的研宄報(bào)告中顯示，丙型副傷寒沙門氏菌會(huì) 通過(guò)某些食物經(jīng)口腔侵染到健康人體，從而引起以上各方面的癥狀。朱翔、包云娟在《浙江 預(yù)防醫(yī)學(xué)》中2011年第23卷第12期發(fā)表的《一起丙型副傷寒沙門氏菌引起的食物中毒調(diào) 查》，根據(jù)該文所述，調(diào)查了一起由家宴引起的丙型副傷寒沙門氏菌的事件，被感染者主要 是由于食用了含有該菌的羊肉和牛肉制品而被感染的。同時(shí)，國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局 的2002年第25和26號(hào)令中明確規(guī)定沙門氏菌為必檢項(xiàng)目。目前，丙型副傷寒沙門氏菌檢 測(cè)主要使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程步驟較多，時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要4-6個(gè)工作日， 而且干擾的因素較多，檢測(cè)結(jié)果的判定較復(fù)雜，給食品檢測(cè)帶來(lái)非常不利的影響。
[0003] 目前，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)的發(fā)展，通過(guò)分 子技術(shù)檢測(cè)鑒定沙門氏菌血清型變得更加可靠。用于丙型副傷寒沙門氏菌的PCR檢測(cè)的 靶基因研宄較少且主要是依賴于國(guó)外學(xué)者的研宄，如David F. Woods，F(xiàn). Jerry Reen等在 《Journal of clinical microbiology》2008 年 12 月 4018-4022 頁(yè)發(fā)表的題為《Rapid Multiplex PCR and Real-Time TaqMan PCR Assays for detection of Salmonella enterica and the Highly Virulent Serovars Choleraesuis and Paratyphi C〉〉中所述， 所獲得的STM3664到STM3674等基因是丙型副傷寒沙門氏菌血清型特異性基因。但通過(guò)進(jìn) 一步分析，以上基因同時(shí)存在鼠傷寒沙門氏菌，由此證明以其作為丙型副傷寒沙門氏菌的 檢測(cè)靶點(diǎn)很可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的現(xiàn)象，以上述基因作為靶基因，會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是通過(guò)基因組比較分析獲得丙型副傷寒沙門氏菌的特異性檢測(cè)靶 基因，從而通過(guò)特異性引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)該目的基因，解決了檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn) 確，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了丙型副傷寒沙門氏菌高特異性快速檢測(cè)的目 的。
[0005] 本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)丙型副傷寒沙門氏菌的PCR引物對(duì)，該特異性引物對(duì)分 別為：pPCl、pPC2、pPC3 ;其中，
[0006] pPCl-f :序列如 SEQ ID NO. 4 所示、pPCl-r :序列如 SEQ ID NO. 5 所示；
[0007] pPC2-f :序列如 SEQ ID NO. 6 所示、pPC2-r :序列如 SEQ ID NO. 7 所示；
[0008] pPC3-f :序列如 SEQ ID NO. 8 所示；pPC3-r :序列如 SEQ ID NO. 9 所示。
[0009] 本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)丙型副傷寒沙門氏菌的特異性靶基因，SPC_0871、 SPC_0872 和 SPC_0908 基因，其中，SPC_0871 堿基序列如 SEQ ID NO. 1、SPC_0872 堿基序列 如SEQ ID NO. 2所示和SPC_0908堿基序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0010] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)丙型副傷寒沙門氏菌的方法，該方法包括以下步驟：
[0011] ⑴提取樣品DNA，PCR擴(kuò)增；（2)凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；（3)比較電泳后條帶，如 果在523bp、212bp和169bp位置有條帶，則證明樣品中含有丙型副傷寒沙門氏菌。
[0012] 本發(fā)明提供檢測(cè)丙型副傷寒沙門氏菌的方法，其中，電泳后523bp位置分離出的 DNA片段，其堿基序列如SEQ ID NO. 1所示；212bp位置分離出的DNA片段，其堿基序列如 SEQ ID NO. 2所示；169bp位置分離出的DNA片段，其堿基序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0013] 本發(fā)明提供的檢測(cè)丙型副傷寒沙門氏菌的方法，其中，PCR檢測(cè)體系，25ul包含 有：2XMaster 12. 5ul，10uM 引物對(duì) lul，模板取 l-5ul，補(bǔ) CldH2O 至 25ul。
[0014] 本發(fā)明提供的檢測(cè)丙型副傷寒沙門氏菌的方法，其中，PCR的反應(yīng)程序：94°C預(yù)變 性10min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，凝膠電泳 采用瓊脂糖凝膠電泳。
[0015] 本發(fā)明提供的檢測(cè)丙型副傷寒沙門氏菌的方法，其中，以25ulPCR反應(yīng)體系計(jì)量， 對(duì)于PPCl引物，需要丙型副傷寒沙門氏菌總DNA濃度彡98. 33pg/ul ;對(duì)于pPC2、pPC3引物， 需要丙型副傷寒沙門氏菌總DNA濃度彡983. 3pg/ul。
[0016] 以上濃度為本發(fā)明的PCR方法針對(duì)3個(gè)不同引物對(duì)的檢測(cè)靈敏度。
[0017] 本發(fā)明還提供上述PCR引物對(duì)在檢測(cè)丙型副傷寒沙門氏菌PCR試劑盒中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)丙型副傷寒沙門氏菌試劑盒，該試劑盒包括引物對(duì)pPCl、 pPC2、pPC3 ;其中，
[0019] pPCl-f :序列如 SEQ ID NO. 4 所示、pPCl-r :序列如 SEQ ID NO. 5 所示；
[0020] pPC2-f :序列如 SEQ ID NO. 6 所示、pPC2-r :序列如 SEQ ID NO. 7 所示；
[0021] pPC3-f :序列如 SEQ ID NO. 8 所示；pPC3-r :序列如 SEQ ID NO. 9 所示。
[0022] 有益效果：
[0023] 本發(fā)明具有以下有益效果：采用本發(fā)明的檢測(cè)方法可直接鑒定丙型副傷寒沙門氏 菌，不需要血清型實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)時(shí)間縮短在12h以內(nèi)。并且，由于檢測(cè)過(guò)程無(wú)需采用傳統(tǒng)檢測(cè) 方法中必須使用的抗血清，可降低檢測(cè)成本。本發(fā)明通過(guò)PCR檢測(cè)特異性DNA片段，具有單 一性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果可靠，結(jié)果判定簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1是引物對(duì)pPCl、pPC2和pPC3對(duì)不同菌種特異性評(píng)價(jià)凝膠電泳結(jié)果圖
[0025] M. DNA Ladder ;1.丙型副傷寒沙門氏菌；2.豬霍亂沙門氏菌；3.鼠傷寒沙門氏 菌；4.傷寒沙門氏菌；5.腸炎沙門氏菌；6.甲型副傷寒沙門氏菌；7.乙型副傷寒沙門氏菌； 8.湯普遜沙門氏菌；9.都柏林沙門氏菌；10.鴨沙門氏菌；11.山夫頓堡沙門氏菌；12.亞利 桑那沙門氏菌；13.波斯坦沙門氏菌；14.阿伯丁沙門氏菌；15.病牛沙門氏菌；16.火雞沙 門氏菌；17.無(wú)菌水。
[0026] A :pPCl引物對(duì)；B :pPC2引物對(duì)；C :pPC3引物對(duì)
[0027] 圖2是引物對(duì)pPCl、pPC2和pPC3對(duì)不同模板濃度靈敏度評(píng)價(jià)凝膠電泳結(jié)果圖
[0028] M :DL2000 ;模板濃度：1-6 :98. 33ng/ul、9. 833ng/ul、983. 3pg/ul、98. 33pg/ul、 9.833pg/ul 和 983. 3fg/ul :
[0029] A :pPCl引物對(duì)；B :pPC2引物對(duì)；C :pPC3引物對(duì)
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段，或按照制造廠商的建議條件，實(shí)施例中涉及的菌株均屬于 現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地從公開(kāi)是商業(yè)渠道獲得。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] PCR檢測(cè)方法對(duì)不同菌種特異性評(píng)價(jià)
[0033] 1.丙型副傷寒沙門氏菌血清型特異性基因的篩選
[0034] 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了丙型副傷寒沙門氏菌RKS4594菌株（NC_012125. 1)的全 基因組序列，根據(jù)比較基因組的方法將該菌基因組的每個(gè)基因利用NCBA網(wǎng)站的Blast程 序進(jìn)行比對(duì)，選擇與該血清型同源性較高（E值=0, Query cover = 0% )同時(shí)與其它微 生物的同源性很低（Query cover < 10% )的基因作為丙型副傷寒沙門氏菌的準(zhǔn)特異性基 因。通過(guò)該方法共獲得7個(gè)丙型副傷寒沙門氏菌的準(zhǔn)特異性基因，再針對(duì)每一個(gè)基因設(shè)計(jì) 多對(duì)引物，利用實(shí)驗(yàn)室保存的沙門氏菌其它血清型進(jìn)行特異性驗(yàn)證。根據(jù)PCR結(jié)果，確定 SPC_0871、SPC_0872和SPC_0908基因作為丙型副傷寒沙門氏菌血清型特異性的檢測(cè)靶點(diǎn)， 基因序列分別如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
[0035] 2.引物設(shè)計(jì)
[0036] 通過(guò)