細胞轉染方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及轉染細胞的方法。具體地，本發(fā)明涉及轉染禽類中原生殖細胞的方法， 以及繁殖具有修飾性狀的禽類的方法。
【背景技術】
[0002] 用以開發(fā)轉基因或基因修飾禽類的有效技術的發(fā)展對于農業(yè)和生物制藥產業(yè)，以 及通過功能基因組學研宄增加我們對禽類生物學的了解均至關重要。在面臨人口增長時， 家禽生產在確保全球食品安全中將扮演重要角色，當今生物技術的進步，例如轉基因家禽 的發(fā)展將有助于該產業(yè)滿足增產的需求。
[0003] 更具體地，應用轉基因技術修飾家禽中無法通過傳統(tǒng)育種獲得的性狀，例如抗病 性和性別決定調節(jié)，如今成為可能，并為家禽產業(yè)提供巨大好處。對于生物制藥蛋白的需求 迅速增長，直到最近仍在使用基于細胞的體外制造系統(tǒng)，其生產用于疾病治療的新重組蛋 白。轉基因家畜作為重組蛋白生產的生物反應器的應用如今正發(fā)展為昂貴且勞動密集的基 于細胞的系統(tǒng)的主要替代。雞轉基因技術的發(fā)展使得雞蛋被開發(fā)成用于高水平生產和純化 生物制藥蛋白的生物反應器。
[0004] 也有試圖導入選定的外源基因，其通過將所述外源基因克隆入逆轉錄病毒載體 (例如網狀內皮病毒或禽類白血病病毒），將重組病毒注入受精卵，允許病毒感染發(fā)育中的 胚胎（例如原生殖細胞）從而建立嵌合性腺或卵細胞，以及使用得到的重組體嘗試將外源 基因導入后代。然而養(yǎng)禽業(yè)不愿意商業(yè)化使用該技術，因為病毒（處于天然狀態(tài)）是病原 體，甚至不同的復制活性的病毒載體某些時候能引起腫瘤，而復制非活性變體需要較高或 反復的劑量。甚至復制缺陷的病毒構建體也能造成與內源病毒包膜重組從而變成復制活性 的風險。另外，這些載體目前局限于尺寸相對較?。ɡ?kb或更?。┑腄NA插入片段。
[0005] 也有試圖將外源DNA注入通過手術從母雞中取出的未發(fā)育的受精卵中。然而，該 方法需要將發(fā)育的胚胎在一系列代孕容器中孵育。另外，其需要專門的產卵群體（laying flock)和反復的練習以獲得所需的手術和技術技能。
[0006] 可替代的方法包括將基因修飾的胚胎細胞或原生殖細胞（PGC)注入產卵后不久 的受體胚胎。在該方法中，生成PCG培養(yǎng)物，其保留了分化成功能性卵細胞或精子的能力， 所述卵細胞或精子在整合入發(fā)育的胚胎中時產生細胞。該類型的PCG培養(yǎng)物能被基因修 飾，然后注入受體胚胎。所述受體胚胎通常會通過γ輻照修飾，削弱內源原生殖細胞，從而 給予被注入的細胞定植于性腺嵴的選擇優(yōu)勢。被修飾的細胞繼而會成熟并產生能夠將轉基 因傳遞到至少下一代的精子或卵細胞。然而，該技術因其需要將PGC從供體胚胎中移除，及 其后續(xù)培養(yǎng)并重新導入受體胚胎而非常耗時。另外，使用該技術所能獲得的包含基因修飾 的PGC的禽類的效率很低。
[0007] 因此，仍有對基因修飾禽類原生殖細胞的方法的需求。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明人發(fā)現，將與DNA混合的轉染試劑直接注入發(fā)育的禽類胚胎血液中導致 DNA被導入原生殖細胞（PGC)，并且所述DNA插入所述禽類的基因組。
[0010] 相應地，本發(fā)明提供用于產生包含基因修飾的生殖細胞的禽類的方法，所述方法 包含：
[0011] (i)將包含與轉染試劑混合的多核苷酸的轉染混合物注入禽類胚胎的血管中，由 此所述多核苷酸插入所述禽類中的一或多個生殖細胞的基因組中。
[0012] 在一個實施方案中，所述方法進一步包含（ii)將所述胚胎在足以使所述胚胎發(fā) 育成小鳥的溫度下孵育。
[0013] 所述轉染混合物優(yōu)選被注入處于約階段12-17PGC迀移時的禽類胚胎。在一個優(yōu) 選實施方案中，所述轉染混合物被注入處于階段13-14的禽類胚胎。
[0014] 盡管任意適合的轉染試劑均可用于本發(fā)明的方法，但優(yōu)選包含陽離子脂質的轉染 試劑。
[0015] 在一個實施方案中，所述轉染試劑包含選自如下一或多種的單價陽離子脂質： DOTMA (N-[l-(2, 3-二油酰氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨）、DOTAP (1，2-雙（油酰氧 基）-3-3-(三甲基氨）丙烷）、DMRIE (1，2-雙十四烷基氧基丙基3-二甲基-羥基乙基銨溴 化物）和DDAB (二甲基雙十八烷基溴化銨）。
[0016] 在另一個實施方案中，所述轉染試劑包含選自如下一或多種的多價陽離子脂質： DOSPA (2, 3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧酰胺）乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨三氟醋酸鹽） 和DOSPER(1，3-二油酰基氧基-2-(6-羧基精胺基）丙酰胺）、TMTPS (四甲基四棕櫚酰精 胺）、TMT0S(四甲基四油烯基精胺）、TMTLS(四甲基四月桂基精胺）、TMTMS(四甲基四肉豆 蔻基精胺）和TMDOS (四甲基二油烯基精胺）。
[0017] 在另一個實施方案中，所述轉染試劑包含DOSPA (2，3-二油基氧基-N- [2-(精胺羧 酰胺）乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨三氟醋酸鹽）。
[0018] 在另一個實施方案中，所述轉染試劑進一步包含中性脂質。所述中性脂質可以包 含例如DOPE (二油酰磷脂酰乙醇胺）、DPhPE (二植烷酰磷脂酰乙醇胺）或膽固醇。
[0019] 在一個具體實施方案中，在轉染試劑與多核苷酸混合之前，所述轉染試劑包含 3:1 (w/w)的 DOSPA 和 DOPE 混合物。
[0020] 有利地，本發(fā)明的所述方法適于將多核苷酸導入生殖細胞基因組的非逆轉錄病毒 方法的應用。因此，在一個實施方案中，所述多核苷酸進一步包含編碼轉位子或鋅指核酸酶 的核苷酸序列。
[0021] 在一個具體實施方案中，所述轉染混合物包含編碼轉座酶的多核苷酸。所述轉座 酶可以由諸如質粒中的DNA編碼，或者可替代地，編碼所述轉座酶的多核苷酸是RNA。
[0022] 在一個特定實施方案中，所述轉座子選自Tol2、mini_Tol2、Sleeping Beauty和 PiggyBac0
[0023] 在另一個實施方案中，所述多核苷酸包含編碼鋅指核酸酶的序列。
[0024] 在禽類中被基因修飾的生殖細胞可以是胚胎生殖細胞，優(yōu)選所述細胞是原生殖細 胞。
[0025] 在一個實施方案中，所述注入混合物被注入蛋殼中的胚胎，所述胚胎在所述蛋殼 中發(fā)育。
[0026] 所述轉染混合物中的多核苷酸可以是RNA分子或編碼多肽的DNA分子，或編碼包 含雙鏈區(qū)域的RNA的DNA分子。在一個具體實施方案中，所述多核苷酸編碼包含雙鏈區(qū)域 的RNA。所述RNA分子可以例如是siRNA、shRNA或RNA誘餌（decoy)。
[0027] 在另一個實施方案中，所述多核苷酸編碼多肽。
[0028] 在一個實施方案中，與缺少所述RNA分子或多肽的細胞相比，所述RNA分子或多肽 減少病毒在細胞中的復制。
[0029] 本發(fā)明的方法可被用于靶向禽類的任意病毒病原體。在一個實施方案中，所述病 毒是流感病毒。
[0030] 本發(fā)明進一步提供包含基因修飾的生殖細胞的禽類，其中所述禽類由本發(fā)明的方 法產生。
[0031] 本發(fā)明進一步提供本發(fā)明的禽類的基因修飾的生殖細胞，其中所述生殖細胞包含 插入到基因組中的多核苷酸。
[0032] 本發(fā)明進一步提供由包含本發(fā)明的基因修飾的細胞的禽類生產的精子。
[0033] 本發(fā)明進一步提供由包含本發(fā)明的基因修飾的細胞的禽類生產的蛋。
[0034] 本發(fā)明進一步提供用于基因修飾禽類中的生殖細胞的方法，所述方法包含：
[0035] (i)將包含與轉染試劑混合的多核苷酸的轉染混合物注入蛋中含有的禽類胚胎的 血管中；以及
[0036] (ii)將所述胚胎在足以允許所述胚胎發(fā)育成小鳥的溫度下孵育；
[0037] 其中所述多核苷酸被插入禽類中的一或多個生殖細胞的基因組中。
[0038] 在另一個實施方案中，所述方法包含本文所述發(fā)明的一或多個特征。
[0039] 本發(fā)明進一步提供了用于產生基因修飾的禽類的方法，所述方法包含：
[0040] (i)獲得包含本發(fā)明的基因修飾的生殖細胞的禽類；
[0041] (ii)由包含基因修飾的生殖細胞的所述禽類繁殖產生后代；以及
[0042] (iii)選擇包含插入到基因組中的多核苷酸的后代。
[0043] 本發(fā)明進一步提供由本發(fā)明的方法產生的基因修飾的禽類。
[0044] 本發(fā)明進一步提供生產食品的方法，所述方法包含：
[0045] (i)獲得包含本發(fā)明的基因修飾的生殖細胞的禽類或本發(fā)明的基因修飾的禽類； 以及
[0046] (ii)由所述禽類生產食品。
[0047] 在一個實施方案中，所述方法包含從所述禽類收獲肉和/或蛋。
[0048] 本發(fā)明進一步提供了繁殖基因修飾的禽類的方法，所述方法包含：
[0049] (i)實施本發(fā)明的方法以產生小鳥或后代；
[0050] (ii)允許所述小鳥或后代發(fā)育成性成熟的禽類；以及
[0051] (iii)由所述性成熟的禽類繁殖產生基因修飾的禽類。
[0052] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供根據本發(fā)明的方法產生的基因修飾的禽類。
[0053] 本發(fā)明進一步提供調節(jié)禽類性狀的方法，所述方法包含：
[0054] (i)將包含與轉染試劑混合的多核苷酸的轉染混合物注入禽類胚胎的血管中，由 此所述多核苷酸插入所述禽類中的一或多個生殖細胞的基因組中；以及
[0055] (ii)將所述胚胎在足以允許所述胚胎發(fā)育成小鳥的溫度下孵育；
[0056] 其中所述多核苷酸編碼調節(jié)禽類性狀的多肽或包含雙鏈區(qū)域的RNA分子。
[0057] 在一個實施方案中，所述RNA分子包含siRNA、shRNA或RNA誘餌。
[0058] 在一個實施方案中，所述性狀選自肌肉質量、性別、營養(yǎng)成分和/或抗病性。
[0059] 本發(fā)明進一步提供增加禽類對病毒抗性的方法，所述方法包含實施本發(fā)明的方 法，其中所述多核苷酸是減少病毒在細胞中復制的siRNA、shRNA或RNA誘餌，或者所述多核 苷酸編碼減少病毒在細胞中復制的抗病毒肽。
[0060] 在一個具體實施方案中，所述病毒是流感病毒。
[0061] 本發(fā)明進一步提供根據本發(fā)明的方法產生的禽類。
[0062] 在本發(fā)明的某些實施方案中，所述禽類選自雞、鴨、火雞、鵝、矮腳雞或鵪鶉。
[0063] 在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述轉染混合物進一步包含靶向性核酸 酶，或編碼靶向性核酸酶的多核苷酸，以便于所述多核苷酸整合入生殖細胞的基因組。例 如，所述靶向性核酸酶可以選自鋅指核酸酶、TALEN和CRISPR。
[0064] 本發(fā)明進一步提供用于產生包含基因修飾的生殖細胞的禽類的方法，所述方法包 含：
[0065] (i)將包含與轉染試劑混合的多核苷酸的轉染混合物注入禽類胚胎的血管中，由 此所述多核苷酸插入所述禽類中的一或多個生殖細胞的基因組中；以及
[0066] (ii)將所述胚胎在足以使所述胚胎發(fā)育成小鳥的溫度下孵育；
[0067] 其中所述轉染試劑包含陽離子脂質，所述多核苷酸進一步包含編碼轉座子的序 列，并且所述轉染混合物被注入處于階段13-14的禽