一種月季黑斑病菌的保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物真菌的保存方法，具體涉及一種月季黑斑病菌的保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]月季黑斑病是由薔薇盤(pán)二孢(Marssonina rosae)引起的一種病害，是月季露地栽培最嚴(yán)重和最普遍的一種病害。該薔薇盤(pán)二孢(Marssonina rosae)真菌的分離、純化、繁殖和保存是開(kāi)展月季種質(zhì)資源黑斑病抗性鑒定、月季黑斑病菌毒性基因遺傳學(xué)、病原和寄主互作關(guān)系和月季黑斑病菌生理小種分化等研宄工作的基礎(chǔ)?，F(xiàn)有技術(shù)的保存方法是將該菌接種到PDA培養(yǎng)基(土豆+葡萄糖+瓊脂)上保存，一般可保存菌種3-5個(gè)月，持續(xù)保存需要每隔3-5個(gè)月重新更換培養(yǎng)基和重新接種。現(xiàn)有技術(shù)的保存方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且菌種的致病力逐漸降低。因此，選擇一種合適的月季黑斑病菌的保存方法勢(shì)在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠使月季黑斑病菌保存時(shí)間更長(zhǎng)，同時(shí)仍能保持強(qiáng)有力的致病力，方法更簡(jiǎn)單、更能增加實(shí)用性的月季黑斑病菌的保存方法。
[0004]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0005]一種月季黑斑病菌的保存方法，包括以下步驟:
[0006](I)月季黑斑病菌的分離和純化培養(yǎng)
[0007]①將感染了黑斑病菌的月季葉片放入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液20s，再用無(wú)菌蒸餾水清洗2-3次，展開(kāi)葉片將其平鋪在盛有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %瓊脂的培養(yǎng)皿中，在室內(nèi)光照強(qiáng)度為1800-32001x，光周期為10-16h光期、8-14h暗期，空氣相對(duì)濕度90-100 %，室溫18-28°C的條件下培養(yǎng)24-48h ；
[0008]②在解剖鏡下用已滅菌的挑針從培養(yǎng)皿中分離出單個(gè)的萌芽真菌孢子，將其轉(zhuǎn)移到盛有營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在室內(nèi)黑暗條件下，且空氣相對(duì)濕度90-100%，室溫為18-28°C培養(yǎng)4-5周，所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基由以下重量份的成分混合而成:麥芽3.5份、酵母2份和瓊脂2份；
[0009](2)月季黑斑病菌的活力性檢測(cè)
[0010]用無(wú)菌蒸餾水將步驟(I)②培養(yǎng)皿中的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基洗掉，保留培養(yǎng)皿中的真菌菌落并轉(zhuǎn)移到離心管中，在3000-5000轉(zhuǎn)/分的條件下離心10-15min，將上清液轉(zhuǎn)移到已滅菌的容器內(nèi)，每次取出上清液lml，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07%的酚藏花紅溶液進(jìn)行真菌孢子的活力性檢測(cè)，有活力的孢子不變色，失去活力的孢子變紅，當(dāng)孢子活力性檢測(cè)值小于90%時(shí)，說(shuō)明孢子活性不夠，繼續(xù)維持步驟(I)②所述培養(yǎng)至檢測(cè)出孢子活力性檢測(cè)值大于或等于90%，當(dāng)孢子活力性檢測(cè)值大于或等于90%時(shí)，將容器內(nèi)上清液中的孢子濃度用無(wú)菌水調(diào)至1 X 105-2X 106個(gè)/ml用于接種備用；
[0011](3)月季黑斑病菌的繁殖和保存
[0012]①繁殖:用噴霧法或滴液法將步驟(2)檢測(cè)得到的孢子活力性檢測(cè)值大于或等于90%，且該孢子溶液濃度調(diào)至1 X 105-2X 106個(gè)/ml的孢子接種到經(jīng)消毒處理的對(duì)月季黑斑病敏感的月季品種的離體葉片上或接種到經(jīng)消毒處理的對(duì)月季黑斑病敏感的月季野生種的離體葉片上，將接種后的離體葉片平鋪于保濕的培養(yǎng)皿中，在室內(nèi)光強(qiáng)1800-32001x、光周期為10-16h光期、8-14h暗期，空氣相對(duì)濕度90-100%，室溫18_28°C的條件下培養(yǎng)7-14d;所述保濕的培養(yǎng)皿為將已滅菌的棉花平鋪于培養(yǎng)皿中，在棉花上滴加1ml的無(wú)菌水；
[0013]②保存:
[0014]取出步驟(3)①培養(yǎng)皿中的離體葉片，用無(wú)菌濾紙吸干該葉片表面的水分后裝入容器中，立刻將該容器放入液氮中速凍5-15min后，取出再放入_70°C?_80°C的超低溫冰箱保存；
[0015](4)月季黑斑病菌的復(fù)活
[0016]從超低溫冰箱中取出容器立刻放入4°C的環(huán)境中，待解凍后，將容器內(nèi)的離體葉片平鋪于保濕的培養(yǎng)皿中，在室內(nèi)光強(qiáng)1800-32001x、光周期為10-16h光期、8-14h暗期，空氣相對(duì)濕度90-100%、室溫18-28°C的條件下培養(yǎng)以備用；所述保濕的培養(yǎng)皿與步驟(3)①所述的保濕的培養(yǎng)皿的保濕方式相同。
[0017]進(jìn)一步，步驟(3)①繁殖中所述的消毒處理是:采集對(duì)月季黑斑病菌敏感的月季品種完全展開(kāi)的無(wú)病蟲(chóng)害的葉片或?qū)υ录竞诎卟【舾械脑录疽吧N的完全展開(kāi)的無(wú)病蟲(chóng)害的葉片，先將采集的葉片進(jìn)行解剖鏡鏡檢，確保所采集的葉片無(wú)任何真菌菌落或菌絲后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的次氯酸鈉處理20s，再用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇處理20s，然后用無(wú)菌的蒸餾水清洗2-3次，用無(wú)菌的濾紙吸干葉片表面的水分。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)和有益效果是:
[0019]1、本發(fā)明所述月季黑斑病菌的分離和純化培養(yǎng)步驟的參數(shù)能使月季黑斑病菌生理小種得到很好的分化和純化培養(yǎng)，能準(zhǔn)確地分離出月季黑斑病菌的某一個(gè)生理小種。而現(xiàn)有技術(shù)不能提供這些參數(shù)，幾乎忽略了此步驟的重要性，因而不能很準(zhǔn)確地分離出月季黑斑病菌的某一個(gè)生理小種，病菌生理小種的混合保存法將不利于后續(xù)的不同生理小種分化和抗性鑒定等實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展和深入。
[0020]2、本發(fā)明中月季黑斑病菌的保存介質(zhì)是對(duì)月季黑斑病敏感的月季葉片，其效果是保存時(shí)間更長(zhǎng)，保存期間無(wú)須額外的重新更換培養(yǎng)基和重新接種等繁雜的步驟。而現(xiàn)有技術(shù)保存介質(zhì)是PDA培養(yǎng)基(土豆+葡萄糖+瓊脂)，只能保存菌種3-5個(gè)月，持續(xù)保存需要每隔3-5個(gè)月重新更換培養(yǎng)基和重新接種，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且菌種的致病力逐漸降低。
[0021]3、本發(fā)明對(duì)孢子活力性的檢測(cè)和范圍值在接種保存前進(jìn)行了實(shí)施和規(guī)定，其效果是月季黑斑病菌在_80°C冰箱中保存3年后，其活力依然很強(qiáng)，其致病力保持不變，致病力達(dá)到100%。
[0022]綜上所述，本發(fā)明方法各步驟的協(xié)同作用，使月季黑斑病菌的保存期延長(zhǎng)至3年，其保存期比現(xiàn)有技術(shù)增長(zhǎng)6.2-11倍，且保存36個(gè)月后，其病菌活力仍達(dá)到于90 %以上，比現(xiàn)有技術(shù)保存的病菌活力提高100%，病菌致病力提高100%，產(chǎn)生了預(yù)料不到的技術(shù)效果O
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下實(shí)施例無(wú)特殊說(shuō)明為常規(guī)方法。
[0024]實(shí)施例1 (本發(fā)明方法)
[0025](I)月季黑斑病菌的分離和純化培養(yǎng)
[0026]①將感染了黑斑病菌的月季葉片放入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液20s，再用無(wú)菌蒸餾水清洗3次，展開(kāi)葉片將其平鋪在盛有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %瓊脂的培養(yǎng)皿中，在室內(nèi)光照強(qiáng)度為20001x、光周期為16h光期、8h暗期，空氣相對(duì)濕度95%、室溫23°C的條件下培養(yǎng)36h ；
[0027]②在解剖鏡下用已滅菌的挑針從培養(yǎng)皿中分離出單個(gè)的萌芽真菌孢子，將其轉(zhuǎn)移到盛有營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在室內(nèi)黑暗條件下，且空氣相對(duì)濕度95%、室溫23°C培養(yǎng)5周，所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基由以下重量份的成分混合而成:麥芽3.5份、酵母2份和瓊脂2份；
[0028](2)月季黑斑病菌的活力性檢測(cè)
[0029]用無(wú)菌蒸餾水將步驟(I)②培養(yǎng)皿中的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基洗掉，保留培養(yǎng)皿中的真菌菌落并轉(zhuǎn)移到離心管中，在4000轉(zhuǎn)/分的條件下離心12min，將上清液轉(zhuǎn)移到已滅菌的容器內(nèi)，每次取出上清液lml，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07%的酚藏花紅溶液進(jìn)行真菌孢子的活力性檢測(cè)，有活力的孢子不變色，失去活力的孢子變紅，當(dāng)孢子活力性檢測(cè)值小于90%時(shí)，說(shuō)明孢子活性不夠，繼續(xù)維持步驟(I)②所述培養(yǎng)至檢測(cè)出孢子活力性檢測(cè)值大于或等于90%，當(dāng)孢子活力性檢測(cè)值大于或等于90%時(shí)，將容器內(nèi)上清液中的孢子濃度用無(wú)菌水調(diào)至1 X 105-2X 106個(gè)/ml用于接種備用；所述質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07%的酚藏花紅溶液的配制是:0.07g酚藏花紅溶解于10ml無(wú)菌水。
[0030](3)月季黑斑病菌的繁殖和保存
[0031]①繁殖:用噴霧法或滴液法將步驟(2)檢測(cè)得到的孢子活力性檢測(cè)值大于或等于90 %，且該孢子溶液濃度調(diào)至I X 105-2 X 16個(gè)/ml的孢子接種到經(jīng)消毒處理的對(duì)月季黑斑病敏感的月季品種‘云彩虹’的離體葉片上，將接種后的月季離體葉片平鋪于保濕的培養(yǎng)皿中，在室內(nèi)光強(qiáng)20001x、光周期為16h光期、8h暗期，空氣相對(duì)濕度95%、室溫23°C的條件下培養(yǎng)14d ;所述保濕的培養(yǎng)皿為將已滅菌的棉花(棉花厚度為0.5cm)平鋪于培養(yǎng)皿中，在棉花上滴加1ml的無(wú)菌水；對(duì)月季黑斑病敏感的月季品種‘云彩虹’的離體葉片的消毒處理是:采集對(duì)月季黑斑病菌敏感的月季品種‘云彩虹’完全展開(kāi)的無(wú)病蟲(chóng)害的葉片，先進(jìn)行解剖鏡鏡檢，確保所采集的葉片無(wú)任何真菌菌落或菌絲后，用質(zhì)量