一種嗜堿鏈霉菌及其產(chǎn)生的中性內(nèi)切葡聚糖酶和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種嗜堿鏈霉菌及其產(chǎn)生的中性葡聚糖酶和 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是植物纖維的主要成分，約占其干重的30~50%，是目前分布最廣的天然 碳水化合物，也是地球上最豐富、最廉價的可再生資源。隨著世界人口的激增、全球經(jīng)濟的 飛速發(fā)展、糧食的短缺和石油、煤炭和天然氣等不可再生資源正W梅人的速度減少，可再生 纖維素資源的開發(fā)利用已引起全世界的普遍關(guān)注，成為世界各國研究的重大課題。纖維素 酶的研究為此開辟了一條廣闊的途徑，特別是近10年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)迅速發(fā)展，基 因重組技術(shù)及其一系列分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，使該一領(lǐng)域的研究更為深入，并在應(yīng)用上 將顯示出其潛在的價值。
[0003] 纖維素酶（cellulase)是降解天然纖維素生成纖維素分子鏈、纖維二糖和葡萄糖 的一組酶的總稱。所W，纖維素酶不是單一成分的酶，而是一組酶系的總稱。目前根據(jù)其催 化功能的不同，普遍認為纖維素酶可分為由H類不同水解功能的酶組成；內(nèi)切葡聚糖酶，外 切葡聚糖酶，目-葡萄糖巧酶。
[0004] I、內(nèi)切型葡萄糖巧酶（end〇-l，4-目-D glucanase，EC3.2. 1.4,簡稱邸G)，也稱 Cx 酶、CMC酶、EG。該類酶作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機識別并水解目-1,4-糖巧 鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量非還原性術(shù)端的小分子纖維素；
[0005] II、外切型葡萄糖巧酶（ex〇-l，4-目-D glucanase，EC3. 2. 1.91)，也稱 C1 酶、微品 纖維素酶、纖維二糖水解酶（cellobiohy化olase，簡稱CBH)，該類酶從纖維長鏈的非還原 性末端水解目-1，4-糖巧鍵，每次切下一個纖維二糖分子；
[0006] III、目-葡萄糖巧酶（目-glucosidase，EC3. 2. 1. 21，簡稱BG)又稱纖維二糖酶，它 能水解纖維二糖W及短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，對纖維二糖和纖維H糖的水解很快，隨 著葡萄糖聚合度的增加水解速度下降，該種酶的專一性比較差。
[0007] 纖維素的降解必須依靠H種組分的協(xié)同作用才能完成。外切目-葡聚糖巧酶從纖 維索的非還原多聚體末端水解1，4-目-糖巧鍵，將天然纖維素分解為直鏈纖維素，使其轉(zhuǎn) 變成水合非結(jié)晶纖維素；內(nèi)切目-葡聚糖巧酶則水解纖維素的內(nèi)在糖巧鍵，將直鏈纖維素 內(nèi)部切斷，分解為纖維二糖和纖維寡糖；而目-葡萄糖巧酶則將纖維二糖分解成兩個葡萄 糖單位。
[0008] 科學(xué)技術(shù)的日新月異，電子順磁共振和頻域英光技、串聯(lián)質(zhì)譜儀、X-射線、傅立 葉紅外光譜儀等技術(shù)在纖維素酶結(jié)構(gòu)研究方面的應(yīng)用，使纖維素酶的結(jié)構(gòu)越來越清晰的 擺在人們面前，該也更有利于研究者們進一步的訖釋纖維素酶的功能。在一級結(jié)構(gòu)和H 維結(jié)構(gòu)的研究中人們發(fā)現(xiàn)，纖維素酶分子普遍具有類似的結(jié)構(gòu)，全酶分子呈峨抖狀，由具 有獨立活性的兩個結(jié)構(gòu)域和連結(jié)序列構(gòu)成大多數(shù)纖維素酶都有由一個或多個催化結(jié)構(gòu)域 (catal^ic domain, CD)和纖維素結(jié)合區(qū)（cellulose binding domain,CBD)組成，中間由 一段可辨認的連接膚（linker peptide)所連接，只有少數(shù)微生物和高等植物產(chǎn)生的纖維素 酶不具有該類結(jié)構(gòu)域，如Trichoderma reesei EG的EG3就沒有CBD結(jié)構(gòu)域。同時還發(fā)現(xiàn) T. reesei 的 EGI 和 CBHI、腐殖菌屬（Humicola spp.)的 Humicola insolens 的 EGV、纖維單 胞菌屬（Cellulomonas. fum)的CenEG在沒有CBD的情況下仍然能水解纖維素，說明對于有 些外切或內(nèi)切酶來說，CBD的結(jié)構(gòu)在水解纖維素的過程中并不是不可缺少的。
[0009] 催化結(jié)構(gòu)域呈球形，主要體現(xiàn)酶的催化機制和對水溶性底物的特異性。內(nèi)切酶的 活性中也位點存在于一個開放的裂口（cleft)中，它可與纖維素鏈的任何部位結(jié)合并切斷 纖維素鏈；外切酶的活性中也位點存在于一個隧道（tunnel)內(nèi)部，它從纖維素鏈的非還原 末端切下纖維二糖。最先被闡明的催化結(jié)構(gòu)域是T. reesei的CBHII的催化域結(jié)構(gòu)，它是 a/目由組成的筒狀結(jié)構(gòu)：由5個a螺旋和7條目鏈組成，活性部位由兩個延伸至表面的 環(huán)（loop)形成一個隧道狀（tunnel)結(jié)構(gòu)，長度大約2nm，包含4個結(jié)合位點，水解糖巧鍵發(fā) 生在第2和第3結(jié)合位點之間。
[0010] 連接膚是保持CD和C抓之間的距離并有助于不同酶分子之間形成較穩(wěn)定聚集體 的一段多膚鏈。細菌纖維素酶的連接橋富含脯氨酸、蘇氨酸，而真菌纖維素酶的連接橋富含 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，不同纖維素酶連接橋的糖基化程度不同，其糖基化的作用是避免 因暴露于水相對蛋白酶敏感而被水解?；痳;細菌纖維素酶C抓與CD夾角為135°，而真菌 為180° ;細菌纖維素酶有兩個酶切位點可將C抓與連接膚分別切去，而真菌纖維素酶一般 只有一個酶切位點可將C抓與連接膚一同切去。由于纖維素全酶分子呈峨抖狀，其連接膚 高度糖基化卻具有較強柔初性，故很難得到結(jié)晶。
[0011] 在纖維素酶的結(jié)構(gòu)中，CBD是高度保守的，尤其是來源相同的纖維素酶。根據(jù)氨基 酸序列的相似性，主要可分為3個家族，C抓家族1 W T. reesei為代表，家族2和3則主要 來源于細菌纖維素酶。結(jié)合區(qū)形狀呈"模形"，一面親水，另一面疏水，一般是指纖維素的內(nèi) 切酶或外切酶中能夠與結(jié)晶纖維素和無定形纖維素結(jié)合的功能域，大多數(shù)纖維素酶的CBD 位于酶蛋白分子的氨基端或駿基端，少數(shù)位于中間，通過連接橋與催化結(jié)構(gòu)域相連。C抓可 能是通過芳香環(huán)與葡萄糖環(huán)的堆積力吸附到纖維素上，由C抓上其余的氨鍵與相鄰的葡萄 糖鏈從纖維素表面脫離開，W利于催化區(qū)的水解作用。通常認為C抓對高效降解纖維素起 到關(guān)鍵的作用，但瑞氏木霉的CBHI和EGI在沒有CBD的情況下仍具有水解纖維素的活性， 說明在有些外切和內(nèi)切酶中CBD的結(jié)構(gòu)可能不是必需的。
[0012] 內(nèi)切葡聚糖酶可W分為H種類型：酸性內(nèi)切葡聚糖酶（最適pH3~5)、中性內(nèi)切 葡聚糖酶（最適P冊~8)和堿性內(nèi)切葡聚糖酶（最適P服~10)。酸性纖維素酶主要用于 棉及其混紡織物的生物拋光整理上。而中性纖維素酶主要用于牛仔布及其服裝的洗舊石磨 處理上。堿性纖維素酶主要家用洗涂劑中，可增強洗涂劑的去污能力，經(jīng)常使用還可改善織 物的表面特性。
[0013] 酸性內(nèi)切葡聚糖酶主要由絲狀真菌產(chǎn)生，其產(chǎn)生菌主要包括里氏木霉、康寧木霉、 黑曲霉等。酸性內(nèi)切葡聚糖酶研究再早，但隨著工業(yè)應(yīng)用范圍的不斷擴展和應(yīng)用研究的不 斷深入，酸性葡聚糖酶也顯現(xiàn)出諸多不足。如中堿性條件下酶活性較低或根本沒有活性、穩(wěn) 定性差、抑值食用范圍窄，而且在酸性條件下處理紡織品后會產(chǎn)生權(quán)色現(xiàn)象等，該極大限制 了內(nèi)切葡聚糖酶在堿性洗涂劑、紡織品酶洗整理等工業(yè)中的應(yīng)用。因此，尋找新型、高效、穩(wěn) 定和抑值適應(yīng)范圍更廣的內(nèi)切葡聚糖酶意義重大。
[0014] 由細菌產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶主要是中性和堿性內(nèi)切葡聚糖酶，在中性和堿性條件 下均具有一定的酶活性及穩(wěn)定性。與真菌產(chǎn)生的酸性內(nèi)切葡聚糖酶相比，由細菌產(chǎn)生的 中性和堿性內(nèi)切葡聚糖酶具有其共同而獨特的優(yōu)越性；（1)抑值適應(yīng)范圍廣，一般在抑值 6-10之間均具有較高的酶活性；（2)穩(wěn)定性好，可W耐受6(TC的高溫；（3)酶成分單一，主 要酶活性成分為內(nèi)切葡聚糖酶，便于工業(yè)應(yīng)用；(4)可用細菌發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵周期短；（5)可 W承受很高的抑值，作為洗涂用酶可使衣物經(jīng)過多次洗涂后手感、外觀等保持鮮艷；(6)可 W在中性環(huán)境中處理紡織品，不會造成紡織品權(quán)色等。可見，對于條件要求甚高的洗涂和紡 織工業(yè)用酶，細菌產(chǎn)中性纖維素酶有比傳統(tǒng)酸性纖維素酶更好的優(yōu)越性。
[0015] 目前研究較多的是真菌和細菌，對放線菌研究得很少。但細菌產(chǎn)生的纖維素酶 的量較少，主要是內(nèi)切酶，大多數(shù)對結(jié)晶纖維素沒有活性，多數(shù)不能分泌到細菌細胞外， 因此工業(yè)上很少采用細菌作為酶的生產(chǎn)菌種。而霉菌的致病菌較多，其抱子易傳播、感 染。諸如此類的原因，限制了細菌和霉菌的使用和開發(fā)。相對而言，放線菌產(chǎn)生的纖維素 酶活性較高，且放線菌是抗菌素的主要生產(chǎn)菌，同時，放線菌結(jié)構(gòu)簡單，為單細胞，便于遺 傳分析。產(chǎn)纖維素酶的放線菌主要有攻瑰色放線菌（Actinomyces Roseus)、纖維放線菌 (A.Cellulase)、鏈霉屬放線菌等，現(xiàn)在國外的許多研究者致力于放線菌的研究。
[0