哺乳動物的胚胎或受精卵的非凍結(jié)低溫保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及在非凍結(jié)低溫下保存哺乳動物的胚胎或受精卵的方法和保存液。
【背景技術(shù)】
[0002] 僅在日本國內(nèi)每年就有6萬個以上的牛胚胎在流通。而且，在北美、南美、歐州以 及亞洲地區(qū)牛胚胎的需求逐年增加。因此，全球都在進行關(guān)于牛胚胎凍結(jié)保存的研宄，開發(fā) 了多種緩慢凍結(jié)法或急速凍結(jié)法，得到了比較穩(wěn)定的受胎率（受孕率）。但是，根據(jù)目前的 技術(shù)水平，只能得到50%左右的受胎率，在此20年以前尚未報道進一步提高受胎率的大的 改善對策。這也許暗示了：哺乳類胚胎的凍結(jié)保存方法達到了某種程度的技術(shù)極限。
[0003] 另外，可以耐受凍結(jié)?融解損傷的胚胎僅限于高品質(zhì)的胚胎，即使通過過剩排卵處 理生產(chǎn)了多個胚胎，也會因各種要因（例如供卵牛的體質(zhì)或供試精子的活力等）而只得到 低品質(zhì)胚胎，此類例子也非常多。但是，這些低品質(zhì)胚胎如果經(jīng)過凍結(jié)處理，也可以移植到 受胎牛的子宮中生產(chǎn)小牛。
[0004] 倘若有在短期內(nèi)在非凍結(jié)狀態(tài)下抑制由供卵?；厥盏呐Ｅ咛サ陌l(fā)育同時使其繼 續(xù)存活的方法，則可以利用送貨上門等的運輸方法，將沒有受到凍結(jié)?解凍所伴隨的損傷的 胚胎以極高的效率用于小牛生產(chǎn)。另外，當(dāng)供卵牛與受卵牛的發(fā)情周期為數(shù)天時，可以根據(jù) 受卵牛的發(fā)情周期調(diào)整移植時期。而且，如果開發(fā)了如上所述的胚胎保存方法，則認為不需 要液氮或深度冷凍器等昂貴的冷凍設(shè)備。即，可以使用家庭用冰箱來保存胚胎。
[0005] 迄今為止，有報道稱：牛胚胎的非凍結(jié)保存以3天（非專利文獻1)為限，羊胚胎的 非凍結(jié)保存以4天（非專利文獻2)為限。另外，據(jù)報道，Zoarces elongatus Kner (長綿 蟵）這種魚種所具有的熱滯后蛋白（Nfe8)以及熱滯后類似蛋白Nfell和Nfe6在低溫環(huán)境 下發(fā)揮細胞延壽功能（專利文獻1)，期待著作為細胞延壽劑的實用化。
[0006] 作為非凍結(jié)低溫胚胎保存對象來研宄的動物種有小鼠、豬、綿羊、牛、稀有物種等， 但每個動物種的胚胎性質(zhì)大不相同。由此，胚胎保存中有效成分或它們的混合率、有效濃度 范圍也大不相同，每個動物種均需查明保存液成分。關(guān)于牛胚胎在非凍結(jié)低溫下的保存方 法，很久以來從受胎率的提高、供卵牛-受卵牛間的發(fā)情同期化問題和低品質(zhì)胚胎的利用 方面進行了研宄，但尚未開發(fā)出有效的保存方法。
[0007] 在這種狀況下，期待著開發(fā)一種哺乳動物胚胎保存液，所述保存液在非凍結(jié)低溫 下更有效地保護或保存哺乳動物胚胎，不僅延長它們的壽命，還保持孵化能力或帶來高受 胎率。另外，還強烈希望開發(fā)哺乳動物胚胎的保存方法，所述保存方法可以在運輸所需的天 數(shù)內(nèi)保存，并且還兼具實現(xiàn)用耗能少的通用性設(shè)備或容器進行保存或運輸?shù)臈l件。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻 專利文獻1 :日本特開2010-248160號公報； 非專利文獻 非專利文獻 1 :Lindner GM and Ellis DE. Refrigeration of bovine embryos. Theriogenology 1985; 23: 202.； 非專利文獻2 :Baguisi A，Arav A，Crosby TF，Roche JF，Boland MP. Hypothermic storage of sheep embryos with antifreeze proteins: development in vitro and in vivo. Theriogenology 1997; 48: 1017-1024〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明所要解決的課題 因此，本發(fā)明的目的在于提供一種與以往相比可以長期在非凍結(jié)狀態(tài)下良好地保存哺 乳動物的胚胎和受精卵、而且還可以高度維持保存后的胚胎的孵化能力或受胎率的手段。
[0010] 用于解決課題的手段 本申請發(fā)明人深入研宄的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過將血清和Good' S緩沖液以特定濃度組合使 用，而不使用Nfell等這樣的細胞延壽肽，可以在非凍結(jié)狀態(tài)下長期保存哺乳動物細胞胚 胎，尤其是使用ffiPES時得到了特別優(yōu)異的效果，即使是在長達7天的時間內(nèi)非凍結(jié)保存哺 乳動物胚胎時，也可以實現(xiàn)非常高的存活率和受胎率，完成了本申請發(fā)明。
[0011] 即，本發(fā)明提供哺乳動物的胚胎或受精卵的保存方法，該方法包括：將哺乳動物的 胚胎或受精卵浸在含有20~80%(V/V)的血清和10~100mM的Good' s緩沖液的培養(yǎng)基 中，在非凍結(jié)低溫下保存上述胚胎或受精卵。本發(fā)明還提供哺乳動物的胚胎或受精卵的保 存液，所述保存液本質(zhì)上由含有20~80%(V/V)的血清和10~100mM的Good' s緩沖液的 培養(yǎng)基構(gòu)成。
[0012] 發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明，不使用特殊成分作為保存液成分，與現(xiàn)有方法相比可以長期在非凍結(jié)狀 態(tài)下保存哺乳動物胚胎和受精卵。在使用ffiPES作為Good's緩沖液時，得到了特別優(yōu)異的 效果，即使是在長達7天的期間內(nèi)非凍結(jié)保存哺乳動物胚胎時，也可以實現(xiàn)非常高的存活 率和受胎率。迄今為止尚不存在實現(xiàn)長達7天的哺乳動物的胚胎或受精卵的非凍結(jié)保存的 例子，如下所述，本發(fā)明對優(yōu)良家畜的培育作出了巨大貢獻。
[0013] 以往，商品用的家畜受精卵（例如黑毛日本牛的7日齡胚胎（桑椹胚））是以浸在 保存液中的狀態(tài)封入被稱作吸管（只卜口一）的直徑為2_、長15cm左右的筒中，再將該 吸管浸在液氮中，將這種狀態(tài)的受精卵作為商品流通。在浸在液氮中的狀態(tài)下，根據(jù)航空 法的規(guī)定無法搭載在飛機上進行運輸，而是通過貨車或卡車的陸運配送至需要者（畜產(chǎn)團 體或畜產(chǎn)農(nóng)家），出現(xiàn)因運輸成本增加而導(dǎo)致家畜受精卵的價格上漲的問題。根據(jù)本發(fā)明， 可以長期非凍結(jié)低溫保存，無需使用液氮，例如可以在裝入小型冷卻箱等中的狀態(tài)下運輸 受精卵（胚胎），還可以通過飛機進行空運，可以以低成本更快速地將受精卵運送到遠方各 地。在胚胎的凍結(jié)保存下在凍結(jié)和融解時胚胎會受到物理損傷，但如果是非凍結(jié)保存，則沒 有這樣的擔(dān)心，因此還可以期待受胎率的提高。
[0014]另外，以往在商品用牛受精卵的制造中，由于供卵牛與受卵牛的發(fā)情期不一致或 低品質(zhì)，大約20%的牛胚胎被廢棄。由于可以在非凍結(jié)狀態(tài)下保存家畜胚胎，所以無法耐受 凍結(jié)?融解的物理損傷的低品質(zhì)胚胎也可以有效利用。而且，即使在供卵母牛與受卵母牛 的發(fā)情周期相差數(shù)天的情況下，也可以根據(jù)受卵母牛的發(fā)情周期調(diào)整移植時期。根據(jù)本發(fā) 明，因發(fā)情期不一致或低品質(zhì)而被廢棄的家畜胚胎也可以有效地實際應(yīng)用。
[0015] 而且，根據(jù)本發(fā)明的方法，不用清洗浸在保存液中的浸漬胚胎或受精卵，可以連同 保存液一起移植到受卵動物的子宮內(nèi)。本申請發(fā)明人之前發(fā)現(xiàn)：通過結(jié)合使用具有細胞延 壽效果的特殊肽（成熟型Nfell)和濃度為20~50%(V/V)左右的血清，可以在非凍結(jié)低溫 下保存牛胚胎最長達5天，作為具有細胞延壽活性的肽，當(dāng)為產(chǎn)業(yè)應(yīng)用時，通常使用通過基 因工程學(xué)方法在大腸桿菌等中表達、純化而獲得的肽。但是，在充分進行重組肽的安全性評 價之前，無法連同包含重組肽的保存液一起移植到受卵動物的子宮中，需要在移植前清洗 胚胎或受精卵。在本發(fā)明中，由于不用清洗重組肽，所以可以將低溫保存后的胚胎不經(jīng)清洗 而直接移植到受卵母牛中，更簡便而且還可以減小對胚胎的物理損傷。
[0016] 附圖簡述 圖1是顯示使用本發(fā)明的保存液將牛胚胎封入吸管內(nèi)進行非凍結(jié)低溫保存時的一個 具體例子的圖。
【具體實施方式】
[0017] 在本發(fā)明的方法中，將哺乳動物的胚胎或受精卵浸在以特定濃度含有血清和 Good' s緩沖液的培養(yǎng)基中，在非凍結(jié)低溫下保存胚胎或受精卵。
[0018] Good' s緩沖液具有不易透過生物體膜、在水中的溶解性高、與金屬離子形成絡(luò)合 物的能力小等共通的特長，認為其除了在胚胎和受精卵的保存中穩(wěn)定培養(yǎng)基的pH以外，還 具有保護非凍結(jié)低溫保存中的胚胎和受精卵的細胞膜的作用。如下述實施例所記載，關(guān)于 Good' s緩沖液所產(chǎn)生的非凍結(jié)低溫下的胚胎和受精卵的延壽效果，在保存中穩(wěn)定培養(yǎng)基 (保存液）的pH這本身并不重要，推測所述延壽效果來自pH穩(wěn)定化以外的細胞膜保護作 用。
[0019] 作為Good' s緩沖液而已知的緩沖劑的具體例子，可以列舉以下的緩沖液。
[0020] MES [2-嗎啉代乙磺酸]; Bis-Tris [雙（2_羥乙基）亞氨基三（羥甲基）甲烷]; ADA [N-(2-乙酰氨基）亞氨基二乙酸]; PIPES [