一種降解原油細(xì)菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物降解原油材料及其應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種降解原油細(xì)菌及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 石油及其產(chǎn)品在開(kāi)采、煉制、貯運(yùn)和使用過(guò)程中進(jìn)入環(huán)境會(huì)造成嚴(yán)重污染；其中溢 油污染危害最大，石油泄漏被稱為海洋污染的超級(jí)殺手。全世界因油輪事故溢入海洋的石 油每年約為39萬(wàn)噸（王傳遠(yuǎn)等，2009)。近年來(lái)中國(guó)每年排入大海的石油約12萬(wàn)噸，中國(guó)近 海海域石油的平均質(zhì)量濃度已達(dá)到0.〇55mg/L，而且污染正日趨加劇。除營(yíng)養(yǎng)鹽之外，石油 烴已成為世界海洋（尤其是淺海）的主要污染物（Al-Majedetal.2012)。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì) 發(fā)展和能源戰(zhàn)略的確定，海運(yùn)將會(huì)有一個(gè)更大的發(fā)展。同時(shí)船舶溢油污染的潛在威脅也在 同步增加。上海港從1999年至2009年共發(fā)生各類船舶油類污染事故173起，油類累計(jì)泄 漏量達(dá)2619. 51噸，平均每年發(fā)生污染事故15. 73起，每年污染物泄漏量達(dá)238. 14噸（陳 維，2010)。
[0003] 目前處理溢油的方法有物理法、化學(xué)法和生物法（Kingetal. 2014)?；瘜W(xué)法由于 使用化學(xué)試劑毒性大，造成生態(tài)環(huán)境危害，難以大范圍廣泛利用。物理法主要有圍欄法、撇 油器法、吸油材料法、活性炭吸附過(guò)濾法等，其中吸附劑處理是最經(jīng)濟(jì)有效的方法。這些物 理主要是應(yīng)對(duì)大規(guī)模、大范圍的海面石油泄漏事故，通過(guò)物理措施將原油吸收、捕捉后再進(jìn) 行分離、回收。但對(duì)于汽、煤、柴油等輕質(zhì)油及大規(guī)模處理后殘余量油，因其密度小、黏度小， 在海面擴(kuò)散速度快等特點(diǎn)，目前工藝方法難以奏效。這些油在海面形成大片油膜，阻隔了大 氣和海水之間的自由交換，妨礙空氣溶解到海水中去，使水中氧減少。影響海洋植物及藻類 的光合作用，對(duì)海洋生物、漁業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害，另一方面它易粘附到其他物體 上或漂到做為療養(yǎng)性地的海濱，影響優(yōu)美的環(huán)境，導(dǎo)致海洋光量下降（桂客，2011)。
[0004] 以油作為生長(zhǎng)底物的細(xì)菌清除油污作為主要的生物處理工藝，其修復(fù)過(guò)程具有安 全性高、經(jīng)濟(jì)性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、去除效率高和無(wú)明顯的二次污染等顯著優(yōu)點(diǎn)（Wiszniowski etal. 2011)。然而細(xì)菌個(gè)體小，移動(dòng)性能差，單純細(xì)菌在油污自然環(huán)境下存活期短生長(zhǎng) 慢，在實(shí)踐應(yīng)用上自主性差，與目標(biāo)接觸慢等缺點(diǎn)，限制了該工藝在實(shí)際中的應(yīng)用（Wanget al. 2013)。因此開(kāi)發(fā)出新的溢油清除菌，對(duì)于減輕油污污染，維護(hù)環(huán)境尤為重要（楊偉華 等，2004)。生物界有著十分豐富的微生物資源，人們對(duì)微生物的認(rèn)知還僅僅局限在一小部 分當(dāng)中。因此，還有大量的具有開(kāi)放潛力的生物表面活性劑菌種未被發(fā)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種降解原油細(xì)菌及其應(yīng)用，該枯草芽孢桿菌 1098-4利于原油降解，以原油為唯一營(yíng)養(yǎng)源生長(zhǎng)，可在1-2天內(nèi)完全降解土壤及水中原油 污染。
[0006] 本發(fā)明的一種降解原油細(xì)菌，該菌株為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillussubtilis 1098-4,保藏號(hào)為CGMCCNo. 9844,其 16SrRNA序列如SEQIDNO. 1 所示。
[0007] 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis) 1098-4,于2014年10月27日保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 9844。
[0008] 本發(fā)明的一種降解原油細(xì)菌的應(yīng)用，應(yīng)用于降解原油，具體為：將菌株接種于培養(yǎng) 基中，37°C條件下，培養(yǎng)1-2天。
[0009] 所述培養(yǎng)基為：每100ml培養(yǎng)基中胰蛋白胨1. 0g，氯化鈉0. 5g，原油10g，100ml去 離子水，pH7. 0-7. 2。
[0010] 本發(fā)明就是分離出一株高效降解原油的細(xì)菌菌株，并利用該菌株進(jìn)行原油污染水 體除油效果。
[0011] 根據(jù)BLAST聚類分析及形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將該菌株定命名為Bacillus SUbtilisl098-4。該菌經(jīng)發(fā)明人檢測(cè)產(chǎn)生表面活性劑，這種功能國(guó)內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)菌株是前 所未見(jiàn)或未有應(yīng)用的，要求保護(hù)該菌株。
[0012] 本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌1098-4的特征如下：
[0013] 該菌菌落表面干躁，邊緣不整齊；呈乳白色不透明；呼吸類型為好氧呼吸，在有氧 條件下生長(zhǎng)良好，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，形態(tài)觀察菌體圓柱形桿狀，菌體長(zhǎng)度為1. 717ym。測(cè) 定菌株的16SrRNA部分序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析（菌株的16SrRNA全序列見(jiàn)附表）。
[0014] 有益效果
[0015] 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌1098-4利于原油降解，以原油為唯一營(yíng)養(yǎng)源生長(zhǎng)，可在 1-2天內(nèi)完全降解土壤及水中原油污染，需要成本低，對(duì)環(huán)境友好。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis) 1098-4菌株降解原油效果，其中a為加 菌前油污染水狀態(tài)；b為培養(yǎng)24小時(shí)后狀態(tài)；c為培養(yǎng)48小時(shí)后狀態(tài)；
[0017] 圖2枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis) 1098-4菌株16SrRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。
[0019] 實(shí)施例1
[0020] 新菌株枯草芽孢桿菌1098-4(Bacillussubtilisl098_4)，已保藏在中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)是：CGMCCNo. 9844。
[0021] 菌種來(lái)源：
[0022] (1)富集取油土樣按5%的接種量接種到富集培養(yǎng)基（牛肉膏0. 5g、蛋白胨lg、 氯化鈉0. 5g,去離子水100mL，pH7. 0~7. 6)中，于37°C、180rpm培養(yǎng)48h。
[0023] (2)初篩取富集液100yL涂布于油平板（以原油為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基）， 37°C培養(yǎng)篩選出生長(zhǎng)的單菌落，挑選出有噬油斑的菌落接種于斜面上。
[0024] (3)復(fù)篩將初篩得到的菌種活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中37°C、180rpm培養(yǎng)，發(fā)酵 液離心后測(cè)其表面張力，重復(fù)幾次做進(jìn)一步的分離純化，最后獲得菌株1098-4。
[0025] 菌種鑒定：
[0026] (1)菌落形態(tài)觀察將菌株Bacillussubtilis1098-4在LB平板上進(jìn)行劃線分 離，24h后觀察菌落的形狀、顏色、表面質(zhì)地、菌落邊緣等并記錄。
[0027] (2)菌體形態(tài)觀察將菌株Bacillussubtilis1098-4制片，進(jìn)行革蘭式染色，用 帶拍攝裝置的光學(xué)顯微鏡觀察菌體的形狀、大小、及其特殊構(gòu)造。
[0028] (3)電鏡觀察將菌株Bacillussubtilis1098-4在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，用 phenon-world臺(tái)式掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)和拍攝。實(shí)驗(yàn)方法如下：
[0029] ①收集菌體：8000rpm離心5min收集菌體，棄上清；
[0030]②固定、脫水：加2. 5%戊二醛固定2h，再用PH為7. 2的磷酸鹽緩沖液固定 2〇-30min；
[0031] ③干燥：加入蒸餾水稀釋，充分混合后用滴管取混合液10-20mL于蓋玻片上吸附 2min，用濾紙吸去多余溶液；
[0032] ④噴金：加0.1 %戊二醛固定lh，再用0.5%戊二醛置換2h，用蒸餾水洗后用 70%、90%、100%的乙醇依次脫水，每次5-10min。最后用雙面膠將載玻片黏在樣品臺(tái)上，噴 金，電鏡觀察。（4)分子鑒定
[0033] ①菌株DNA的提取方法
[0034]A、取lml細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)液移至1. 5mL的Eppendorf管中，5000rpm離心10分鐘，去 上清液；
[0035] B、立即加入600yL預(yù)熱的提取緩沖液，混勻后，65°C溫浴lh;
[0036]C、冰浴冷卻（5分鐘），加入600yL酚/氯仿（1:1)溶液，顛倒混勻后，靜置lOmin， 然后 12000rpm離心 6min;
[0037] D、上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)Eppendorf管中，加入等體積氯仿，靜置5min，12OOOrpm離 心 5min;
[0038]E、取上清液，加入等體積異丙醇，沉淀DNA;
[0039]F、用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于500yLTE或重蒸水 中，-20 °C保存。如DNA沉淀無(wú)法撈出，可5000rpm離心，使DNA沉淀；
[0040] ②16SrRNA的基因擴(kuò)增
[0041] A、PCR反應(yīng)引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/AAGGAGGTGATCCAGCCGC
[0042]B、在冰上建立PCR反應(yīng)體系：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種降解原油細(xì)菌，其特征在于：該菌株為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis1098-4,保藏號(hào)為CGMCCNo. 9844,其 16SrRNA序列如SEQIDNO. 1 所示。
2. -種如權(quán)利要求1所述的降解原油細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于：應(yīng)用于降解原油，具體 為：將菌株接種于培養(yǎng)基中，37°C條件下，培養(yǎng)1-2天。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種降解原油細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于：所述培養(yǎng)基為：每 100mL培養(yǎng)基中胰蛋白胨I. 0g，氯化鈉0. 5g，原油10g，100mL去離子水，pH7. 0-7. 2。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種降解原油細(xì)菌及其應(yīng)用，該菌株為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis1098-4，保藏號(hào)為CGMCC No.9844，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。應(yīng)用于降解原油。該枯草芽孢桿菌1098-4利于原油降解，以原油為唯一營(yíng)養(yǎng)源生長(zhǎng)，可在1-2天內(nèi)完全降解土壤及水中原油污染。CGMCC No.984420141027
【IPC分類】B09C1-10, C12R1-125, C12P19-02, C02F103-08, C02F3-34, C12N1-20
【公開(kāi)號(hào)】CN104694439
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510131238
【發(fā)明人】曹張軍, 雷曉輝
【申請(qǐng)人】東華大學(xué), 中國(guó)水利水電科學(xué)研究院
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年3月24日