一種分離血液流體中腫瘤細(xì)胞的裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及流體中細(xì)胞分離領(lǐng)域，具體涉及一種分離血液流體中腫瘤細(xì)胞的裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)中，在需要分離和檢測活體動(dòng)物(包括人體)血液中癌細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)時(shí)，大多是通過抽取一定量的血液，再經(jīng)過密度梯度離心法等方法進(jìn)行細(xì)胞分選和計(jì)數(shù)。密度梯度離心法是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分選。但其缺點(diǎn)明顯。因此，本領(lǐng)域需要一種新的裝置和方法用于分離和檢測活體動(dòng)物血液中癌細(xì)胞的數(shù)目。近年來，本領(lǐng)域出現(xiàn)通過使用徑跡蝕刻膜來分離血液中癌細(xì)胞的方法，例如崔浣華、王世成等人公開的《聚碳酸酯徑跡微孔濾膜的制備和應(yīng)用》中公開使用徑跡微孔濾膜診斷血液中的癌細(xì)胞，具體是將截留在徑跡微孔濾膜上的癌細(xì)胞放入顯微鏡下觀察。本發(fā)明的發(fā)明人也使用該膜來分離某些活體動(dòng)物(如小兔子)和人的血液中的癌細(xì)胞并對該癌細(xì)胞進(jìn)行診斷和計(jì)數(shù)。但這樣的方法對應(yīng)的裝置僅能一次分離活體動(dòng)物極少部分血液中的癌細(xì)胞，而不能對活體動(dòng)物的大部分或全部血液中的癌細(xì)胞進(jìn)行有效分離，尤其對于個(gè)體較大的活體動(dòng)物(如人體)來說，這一缺陷顯得尤為突出。原因是，為了保持動(dòng)物處在正常生存狀態(tài)下不可能將活體動(dòng)物的全身血液放光以分離其中癌細(xì)胞，這樣個(gè)體會(huì)死亡。另外，由于血液中的腫瘤細(xì)胞(CTC)數(shù)量極為稀少，如果只抽取活體動(dòng)物的少量血液進(jìn)行分離檢測，其分離檢測的敏感性會(huì)大大降低；而增加處理血液量，對活體動(dòng)物的健康和生命都是威脅。
[0003]因此，本發(fā)明的發(fā)明人在先申請的已授權(quán)專利CN201410016566.3中提供一種流體膜過濾細(xì)胞分離裝置(如本發(fā)明附圖5所示)，包括第一驅(qū)動(dòng)泵(I)、第二驅(qū)動(dòng)泵(2)、分離柱(3)、檢測柱(4)和若干個(gè)三通閥和副驅(qū)動(dòng)泵，所述副驅(qū)動(dòng)泵包括第一副泵(11)和第二副泵(12);所述分離柱的一端通過第一三通閥(5)與第一驅(qū)動(dòng)泵⑴相連，另一端通過第二三通閥(6)與第二驅(qū)動(dòng)泵(2)相連，所述檢測柱(4)與第一三通閥(5)的第三個(gè)通道口相連；所述分離柱(3)內(nèi)包含并聯(lián)的至少五根子過濾柱，所述子過濾柱包括固定支架和依附在固定支架底端及側(cè)面四周的聚碳酸酯或聚酯材質(zhì)的徑跡蝕刻膜(7)，徑跡蝕刻膜孔徑為5-25 μm;所述檢測柱(4)包含活動(dòng)連接的上下兩部分，兩部分的外側(cè)均設(shè)置與管道相適應(yīng)的液體通道口(8)，密封的兩部分之間的內(nèi)空處設(shè)置一層聚碳酸酯或聚酯材質(zhì)的徑跡蝕刻膜(7)，徑跡蝕刻膜的孔徑為5-25 μ m;且在第一驅(qū)動(dòng)泵(I)與第一三通閥(5)之間設(shè)置第三三通閥(9)，所述第三三通閥的另一通道與驅(qū)動(dòng)抗凝生理鹽水的第一副泵(11)連接，和在第二三通閥(6)與出樣口(21)之間設(shè)置第四三通閥(10)，所述第四三通閥與驅(qū)動(dòng)抗凝拮抗劑的第二副泵(12)連接；所述裝置利用三通閥、分離柱和檢測柱構(gòu)成兩條運(yùn)行通路；其中，第一條通路為大樣本量的細(xì)胞混懸液從細(xì)胞液體容器(18)經(jīng)進(jìn)樣口(20)、第一驅(qū)動(dòng)泵(I)、第一三通閥(5)進(jìn)入分離柱(3)而后從另一端流出，進(jìn)行過濾后再通過出樣口(21)回到細(xì)胞液體容器(18)，通過細(xì)胞液體容器-泵-分離柱的不斷循環(huán)來進(jìn)行分離，達(dá)到高效分離特定大體積細(xì)胞的目的；第二條通路為調(diào)節(jié)第一三通閥(5)和第二三通閥(6)，關(guān)閉進(jìn)樣口(20)和分離柱(3)的連接通道，流體從第二驅(qū)動(dòng)泵(2)反向流過分離柱(3)而后從另一端流出，進(jìn)入檢測柱(4)，該通路對分離柱(3)上截留下來的特定大體積細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行富集，將其集中在檢測柱(4)的過濾膜上，以便對膜上細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)下游操作檢測，廢液從檢測柱(4)的另一端流出。
[0004]但本發(fā)明的發(fā)明人在隨后的研宄中發(fā)現(xiàn)該裝置仍有不足，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍需要在改進(jìn)該裝置方面做出努力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]因此，本發(fā)明提供一種分離血液流體中腫瘤細(xì)胞的裝置，包括通過主循環(huán)管道依次串聯(lián)且能循環(huán)流通的流體進(jìn)樣口、第一驅(qū)動(dòng)泵、分離柱和流體出樣口，所述第一驅(qū)動(dòng)泵為蠕動(dòng)泵，且在所述進(jìn)樣口和分離柱之間的主循環(huán)管道上還設(shè)置有抗凝生理鹽水注入口，以及在所述分離柱和出樣口之間的主循環(huán)管道上還設(shè)置有抗凝拮抗劑注入口 ；
[0006]所述抗凝拮抗劑注入口與所述分離柱之間的主循環(huán)管道為沒有任何側(cè)壁開口的封閉管道，且所述抗凝拮抗劑注入口與所述出樣口之間的主循環(huán)管道也為沒有任何側(cè)壁開口的封閉管道；所述分離柱中設(shè)置有兩個(gè)以上的子過濾柱，且每個(gè)子過濾柱上均設(shè)置有用于分離腫瘤細(xì)胞的徑跡蝕刻膜，所述徑跡蝕刻膜的孔徑為5-25um，且每個(gè)子過濾柱中的徑跡蝕刻膜形成獨(dú)立的立體過濾通道；所述裝置還包括細(xì)胞收集器；
[0007]所述裝置先后構(gòu)成兩條運(yùn)行通路；其中，第一條通路為血液從細(xì)胞液體容器經(jīng)進(jìn)樣口、第一驅(qū)動(dòng)泵進(jìn)入分離柱而后從其另一端流出，再通過出樣口回到細(xì)胞液體容器，通過細(xì)胞液體容器-泵-分離柱的不斷循環(huán)來進(jìn)行過濾分離，達(dá)到高效分離血液中腫瘤細(xì)胞的目的；同時(shí)分別從所述抗凝生理鹽水注入口和所述抗凝拮抗劑注入口向主循環(huán)管道中注入抗凝生理鹽水和抗凝拮抗劑；第二條通路為與第一條通路流動(dòng)方向相反的非循環(huán)通路，其中，第二液流從所述出樣口和/或所述抗凝拮抗劑注入口注入主循環(huán)管道中，第二液流流經(jīng)所述分離柱并流至位于第二液流流動(dòng)方向上的分離柱下游的細(xì)胞收集器中。
[0008]本發(fā)明提供的徑跡蝕刻膜7的孔徑與待分離的癌細(xì)胞的大小匹配，使得血液中正常的紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板以及其他小分子均能正常濾過，而癌細(xì)胞截留在徑跡蝕刻膜7的上游側(cè)。本發(fā)明中，所述徑跡蝕刻膜7可以設(shè)置在固定支架的外側(cè)、內(nèi)側(cè)或嵌在支架中，本發(fā)明中對此無限制。本發(fā)明中，所述分離柱3和檢測柱42均可以自由地水平放置或豎直放置或以其它方式放置，均不影響本發(fā)明的實(shí)施。
[0009]本發(fā)明中，每個(gè)子過濾柱中的徑跡蝕刻膜形成獨(dú)立的立體過濾通道是指子過濾柱中的徑跡蝕刻膜并非是單張平面徑跡蝕刻膜，也不是由流體同一方向流動(dòng)所經(jīng)過的平行的多張平面徑跡蝕刻膜。本發(fā)明中，朝不同方向設(shè)置的徑跡蝕刻膜封閉地構(gòu)成(或者與膜支架共同構(gòu)成)子過濾柱的過濾通道。本發(fā)明中，所述徑跡蝕刻膜可以形成圓柱形流體通道，也可以形成立方體形流體通道。例如片狀子過濾柱的平行相對的兩個(gè)最大表面封閉徑跡蝕刻膜(流動(dòng)流經(jīng)這兩張徑跡蝕刻膜的方向不同)，而其它幾個(gè)小的表面使用塑料封閉，除入口面以外的其它五個(gè)表面構(gòu)成立體的過濾通道。
[0010]在本發(fā)明中，某段主循環(huán)管道為沒有任何側(cè)壁開口的封閉管道是指沒有任何流體流動(dòng)管道接入該段主循環(huán)管道中而供流體從此處流入或流出主循環(huán)管道。
[0011]本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解的，所述抗凝生理鹽水注入口 9可以位于流體進(jìn)樣口 20與所述蠕動(dòng)泵I之間，也可以位于所述蠕動(dòng)泵I和分離柱3之間，都不影響本發(fā)明的實(shí)施。
[0012]本發(fā)明中，用于反向沖出截留在徑跡蝕刻膜上的腫瘤細(xì)胞的第二液流可以是PBS、TBS等緩沖液，或者是等滲液生理鹽水。
[0013]在一種具體的實(shí)施方案中，使用第一驅(qū)動(dòng)泵反向運(yùn)轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)完成所述第二液流在第二條通路中的流動(dòng)，所述細(xì)胞收集器連接在第二液流流動(dòng)方向上的第一驅(qū)動(dòng)泵下游。
[0014]在另一種具體的實(shí)施方案中，所述裝置還包括通過管道從所述抗凝生理鹽水注入口連接至主循環(huán)管道的第一副泵，且所述第一副泵為蠕動(dòng)泵；使用第一副泵驅(qū)動(dòng)完成所述第二液流在第二條通路中的流動(dòng)，所述細(xì)胞收集器連接在第二液流流動(dòng)方向上的第一副泵下游。
[0015]在另一種具體的實(shí)施方案中，所述裝置還包括通過管道從所述抗凝拮抗劑注入口連接至主循環(huán)管道的第二副泵，所述第二副泵為蠕動(dòng)泵；使用第二副泵驅(qū)動(dòng)完成所述第二液流在第二條通路中的流動(dòng)，所述細(xì)胞收集器連接在第二液流流動(dòng)方向上的分離柱下游。
[0016]本領(lǐng)域技術(shù)人