一種微藻藻株人工選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本專利屬于微藻培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域(C12N1/12),是一種微藻藻株人工選育方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微藻為自養(yǎng)型微生物，因其細(xì)胞內(nèi)存在光合作用系統(tǒng)也稱為微藻植物。微藻具有高效吸收太陽能、固定二氧化碳產(chǎn)生生物質(zhì)的能力(即光合作用能力)；同時(shí)微藻作為微生物的一種，其增殖速度較快。作為單細(xì)胞生物，微藻的主要組成為蛋白、脂肪、碳水化合物和核酸等。目前，微藻已經(jīng)是重要的養(yǎng)殖餌料被養(yǎng)殖企業(yè)廣泛應(yīng)用，同時(shí)微藻也已經(jīng)成為類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、多糖等保健食品的來源。隨著化石能源枯竭的預(yù)期加劇，微藻在能源制品和精細(xì)化學(xué)品的潛在應(yīng)用也得到了極大關(guān)注。
[0003]目前，實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的藻種多從自然界直接分離獲得，后代的性狀單一，容易出現(xiàn)對環(huán)境的適應(yīng)能力差以及藻種退化等問題。以傳統(tǒng)的方法進(jìn)行藻種的復(fù)壯或重新選育優(yōu)良藻株，往往需要較長的周期和花費(fèi)大量的人力。為了獲得高產(chǎn)及滿足下游煉制需求的藻株，必須改進(jìn)微藻的育種技術(shù)，從而對微藻的種質(zhì)進(jìn)行改良。
[0004]常壓室溫等離子體(ARTP)是近幾年來發(fā)展起來的一種新的等離子體源，能夠在常壓(Iam)下產(chǎn)生溫度在25?40°C之間的、具有高活性粒子(如處于激發(fā)態(tài)的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)濃度的等離子體射流。科學(xué)研究表明，等離子體中適當(dāng)劑量的活性粒子作用于微生物，能夠使微生物細(xì)胞壁/膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并引起基因損傷，進(jìn)而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)顯著變化，最終導(dǎo)致微生物產(chǎn)生致畸突變。
[0005]常規(guī)微藻藻株篩選也是一個(gè)耗時(shí)較長的工作，因?yàn)榇蠖鄼z測方法都是基于獲得一定生物量基礎(chǔ)上開展的。如，常規(guī)的微藻油脂評估至少需要數(shù)百毫升微藻藻液，從固體平板至所需要生物量平均需要一個(gè)月的培養(yǎng)時(shí)間。而同時(shí)，誘變篩選可能獲得上百個(gè)備選藻株，因此，適宜的誘變后篩選技術(shù)也是微藻藻株選育的重要一環(huán)。
[0006]隨著各種染色方法靈敏度的提高，利用染色法對微藻生物質(zhì)進(jìn)行評估需要生物量大大少于常規(guī)方法，為提高篩選提供了可能，如，碘液可以對細(xì)胞內(nèi)的淀粉進(jìn)行染色，以熒光染料尼羅紅可以對細(xì)胞內(nèi)的中性脂進(jìn)行染色等。
[0007]因此，基于上述分析，本發(fā)明提出了一種新型微藻藻株人工選育方法，將等離子體誘變與基于染色的快速篩選相結(jié)合，具有高效、快速獲得目標(biāo)藻株的特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種微藻藻株人工選育方法。
[0009]野生藻株的馴化和改良是微藻工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)所必需的，為了提高微藻藻株選育的速度，本發(fā)明結(jié)合了綠色無污染的常壓室溫等離子體誘變、基于吸光度與特異性熒光染料熒光強(qiáng)度變化的藻株篩選技術(shù)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)藻株高效、快速獲得的目的。
[0010]本發(fā)明利用常壓室溫等離子體對野生藻株進(jìn)行誘變，即使用室溫常壓等離子體儀對微藻培養(yǎng)液進(jìn)行誘變。其中待誘變微藻細(xì)胞濃度在100-1000萬細(xì)胞/毫升，誘變微藻藻液在10?200 μ L，電源輸出功率為50?200W，工作氣流量為I?20SLM，等離子體發(fā)射源與樣品之間距離為I?1mm,放電時(shí)間5秒?2分鐘。
[0011]所述誘變操作結(jié)束后，將誘變處理后的微藻涂布于固體培養(yǎng)基上，在選擇壓力(溫度、光強(qiáng)、缺陷培養(yǎng)基)或正常培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)以未誘變處理的藻液作為對照。誘變成功的判定標(biāo)準(zhǔn):對于正常培養(yǎng)條件下，至藻落生長出后，分別對誘變和對照組進(jìn)行藻落計(jì)數(shù)，以致死率=(1-誘變藻落數(shù)/對照藻落數(shù))X 100%大于或等于90%為成功誘變的指標(biāo)，對生長出誘變藻落進(jìn)行96孔板培養(yǎng)篩選；對于選擇壓力下，生長出的藻落即用于96孔板培養(yǎng)篩選。
[0012]所述藻落在96孔板中進(jìn)行液體培養(yǎng)，利用酶標(biāo)儀或者具有孔板掃描功能的分光光度計(jì)對孔板培養(yǎng)的微藻OD值進(jìn)行測定，獲得藻細(xì)胞生長情況。根據(jù)不同微藻藻株可選用不同的檢測波長，如金藻通常使用650?680nm檢測，綠藻通常使用750nm檢測。
[0013]所述液體培養(yǎng)微藻通過特異性染色劑進(jìn)行染色，以顯色強(qiáng)弱對目標(biāo)代謝物生產(chǎn)情況進(jìn)行檢測。通常利用碘液對細(xì)胞內(nèi)淀粉進(jìn)行染色，以熒光染料尼羅紅或者BODIPY對細(xì)胞內(nèi)中性脂或者油脂進(jìn)行染色。
[0014]最終，根據(jù)篩選目的，結(jié)合生長于代謝物生產(chǎn)情況，確定對應(yīng)的誘變藻株，用于后續(xù)研究或生產(chǎn)實(shí)踐。
[0015]本發(fā)明是在室溫、大氣壓、低電壓環(huán)境下使用等離子體對微藻進(jìn)行誘變，避免了常規(guī)物理化學(xué)誘變方法的毒性或強(qiáng)細(xì)胞損傷，同時(shí)處理時(shí)間短，誘變處理過程僅有幾分鐘；利用96孔板培養(yǎng)作為篩選基礎(chǔ)，將OD檢測與特異性顯色反應(yīng)結(jié)合，避免了常規(guī)檢測過程中需要較長培養(yǎng)時(shí)間以獲得足量生物質(zhì)的弊端，同時(shí)可對大量藻株進(jìn)行測定，從藻落到初步篩選出目標(biāo)藻株的時(shí)間縮短至一周左右。因此本發(fā)明相對常規(guī)微藻藻株選育是一種綠色、高效、快速的新方法。
【附圖說明】
[0016]圖1湛江等鞭金藻誘變處理時(shí)間與致死率曲線。
[0017]圖2野生株與23株誘變藻株的相對生長速度。
[0018]圖3誘變藻株相對野生株的相對生長速率與相對單位OD尼羅紅熒光強(qiáng)度。
[0019]圖4以耐高溫和高油脂為目標(biāo)的誘變藻株篩選。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1:
[0021]以湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis FACHB-1750,保藏于中國科學(xué)院武漢水生生物所藻種保藏中心)為對象，利用清華大學(xué)化學(xué)工程與工程物理系聯(lián)合研制的常壓室溫等離子體育種機(jī)(ARTP)進(jìn)行金藻的誘變。
[0022]1、將湛江等鞭金藻培養(yǎng)液濃度調(diào)整至100?1000萬細(xì)胞/毫升，取10?200微升藻液放到載片上。
[0023]2、將載片放置在載臺(tái)上，調(diào)整射流出口與載片的距離小于等于10mm。
[0024]3、電源輸出功率為50?200W，工作氣流量為I?20SLM，放電時(shí)間5秒?2分鐘。
[0025]4、將載片用800微升金藻培養(yǎng)液(天然海水+F/2培養(yǎng)基)沖洗，并盡可能全部回收培養(yǎng)液，用于后續(xù)的固體培養(yǎng)基涂布。
[0026]5、在固體F/2培養(yǎng)基上涂布回收的不同處理?xiàng)l件下的誘變藻液,放置于25度,光照周期14h: 10h，光強(qiáng)50 μ Em-2S-1培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。以同體積未誘變處理的藻作為對照在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
[0027]6、經(jīng)過三至四天，可見固體培養(yǎng)基上生長出單個(gè)藻落。以致死率大于等于90%為標(biāo)準(zhǔn)，將該條件下固體培養(yǎng)基上的微藻藻落轉(zhuǎn)移至96孔板中，每個(gè)藻落占用I個(gè)孔，孔中預(yù)先加好100微升金藻培養(yǎng)液。將96孔板放置于25度,光照周期14h:1Oh,光強(qiáng)50 μ EnT2S4培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0028]7、每天利用酶標(biāo)儀在655nm處進(jìn)行OD測定。
[0029]8、按照標(biāo)準(zhǔn)的尼羅紅染色條件對孔板培養(yǎng)的金藻進(jìn)行染色，使用具有孔板掃描功能的熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，用于檢測細(xì)胞內(nèi)中性脂含量。
[0030]9、根據(jù)OD變化進(jìn)行最大比生長速率計(jì)算，同時(shí)，計(jì)算單位OD下的尼羅紅熒光，并根據(jù)最大比生長速率和單位OD下尼羅紅熒光為指標(biāo)，確定候選誘變藻株，進(jìn)行后續(xù)生產(chǎn)或研究工作。其中，處理時(shí)間與致死率關(guān)系、相對生長速率以及相對單位OD尼羅紅熒光強(qiáng)度值見附圖1?3。
[0031]實(shí)施例2:
[0032]誘變等操作同實(shí)施例1，以耐高溫為目標(biāo)進(jìn)行篩選，將誘變后涂完的平皿置于36°C培養(yǎng)；光強(qiáng)為30?50 μ mo I.πΓ2.s_\光暗比為14:10。
[0033]最終獲得9株耐高溫和高油脂含量藻株，其中對照為正常培養(yǎng)條件下的野生株。
[0034]實(shí)施例3:
[0035]高產(chǎn)淀粉海洋綠藻亞心形四月藻(Tetraselmis subcordiformisFACHB_1751,保藏于中國科學(xué)院武漢水生生物所藻種保藏中心)藻株選育。以150萬細(xì)胞/毫升四月藻進(jìn)行誘變，等離子體發(fā)射源與樣品之間距離為2mm，培養(yǎng)液為天然海水+康維方營養(yǎng)鹽，誘變時(shí)間30s。誘變后將四月藻藻液稀釋一萬倍，涂康維方固體平板。其它操作同實(shí)施例1。
[0036]經(jīng)過誘變，致死率為99.6%。誘變藻株的淀粉含量以碘染顯色值為指標(biāo)進(jìn)行考察。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種微藻藻株人工選育方法，，其特征在于:包括微藻藻株常壓室溫等離子體誘變和基于吸光度與特異性熒光染料熒光強(qiáng)度變化的藻株篩選流程，具體操作包括: (1)利用常壓室溫等離子體對天然藻株進(jìn)行誘變:使用室溫常壓等離子體儀對微藻培養(yǎng)液進(jìn)行誘變； (2)將誘變處理后的微藻涂布于固體培養(yǎng)基上，在選擇性壓力條件下或正常培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)以未誘變處理的藻液作為對照，對于正常培養(yǎng)條件下，至藻落生長出后，分別對誘變和對照組進(jìn)行藻落計(jì)數(shù)，以致死率=(1-誘變藻落數(shù)/對照藻落數(shù))X 100%大于或等于90%為成功誘變的指標(biāo)，對生長出誘變藻落進(jìn)行96孔板培養(yǎng)篩選；對于選擇壓力下，生長出的藻落即用于96孔板培養(yǎng)篩選； (3)利用酶標(biāo)儀或者分光光度計(jì)對孔板培養(yǎng)的微藻OD值進(jìn)行測定，獲得藻細(xì)胞生長情況； (4)利用染料對孔板中液體培養(yǎng)的微藻細(xì)胞進(jìn)行染色，測定細(xì)胞內(nèi)代謝物的積累情況； (5)以生長速度變化或代謝物含量變化情況為指標(biāo)，最終確定目標(biāo)藻株。
2.按照權(quán)利要求1中所述微藻藻株人工選育方法，其特征在于:天然藻株包括綠藻、金藻、硅藻單細(xì)胞藻類或者螺旋藻。
3.按照權(quán)利要求1所述微藻藻株人工選育方法，其特征在于:待誘變微藻細(xì)胞濃度在100-1000萬細(xì)胞/毫升，誘變微藻藻液在10?200 μ L，電源輸出功率為50?200W，工作氣流量為I?20SLM，等離子體發(fā)射源與樣品之間距離為I?10mm，放電時(shí)間5秒?2分鐘。
4.按照權(quán)利要求1所述微藻藻株人工選育方法，其特征在于:正常培養(yǎng)條件為目標(biāo)微藻常規(guī)培養(yǎng)條件；選擇壓力性條件為根據(jù)期望誘變藻株所具有的特點(diǎn)，在正常培養(yǎng)條件下，升高或降低溫度，增強(qiáng)或減弱光照，使用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基或含有重金屬離子、含鹵素有機(jī)化合物、烴類化合物或抗生素的培養(yǎng)基。
5.按照權(quán)利要求1所述微藻藻株人工選育方法，其特征在于:根據(jù)期望得到的誘變藻株性狀，以生長速度提高或降低、在選擇性壓力條件下能夠存活以及細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)代謝物的含量聞低為指標(biāo)，確定最終的目標(biāo)操株。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種微藻藻株人工選育方法，包括微藻藻株常壓室溫等離子體誘變和基于吸光度與特異性染料發(fā)光強(qiáng)度變化的藻株篩選流程。本發(fā)明的特征是將常壓室溫等離子體誘變技術(shù)、基于吸光度的微藻生長測試和基于熒光染料的微藻油脂評估方法結(jié)合，相對于已有微藻藻株選育方法，具有高效、快速獲得目標(biāo)藻株的特點(diǎn)。
【IPC分類】C12N13-00, C12N15-01, C12R1-89
【公開號(hào)】CN104711249
【申請?zhí)枴緾N201310691127
【發(fā)明人】薛松, 艾江寧, 曹旭鵬
【申請人】中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2013年12月13日