一種確定rna完整性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種對生物樣品中RNA完整性（integrity)進行定量的方法，并且更 特別地，涉及對mRNA完整性進行定量的方法。本發(fā)明的方法不僅有助于定量目的樣品中 RNA的完整性，而且提供了一種在考慮RNA降解程度的情況下校正mRNA表達之定量結(jié)果的 手段。本發(fā)明的方法可用在多種應(yīng)用中，包括但不限制于，提供更精確地測定mRNA表達水 平的手段，例如在診斷或監(jiān)測以mRNA水平改變表征之病癥的情況下。
【背景技術(shù)】
[0002] 在本說明書中對任何現(xiàn)有出版物（或來源于其的信息）或?qū)θ魏我阎挛锏膮?考，不是并且也不應(yīng)被看作是承認或認可或以任何形式暗示現(xiàn)有出版物（或來源于其的信 息）或已知事物形成了本說明書所涉及領(lǐng)域的公知常識的一部分。
[0003] 基因表達評估的精確性受起始RNA數(shù)量和質(zhì)量的影響。RNA的純度和完整性是基 于RNA的分析整體成功的關(guān)鍵因素。以低質(zhì)量的RNA開始可能嚴重危害下游應(yīng)用的結(jié)果， 其往往是勞動密集的、耗時的和高成本的。因此在分子生物學(xué)中以及在診斷應(yīng)用中，優(yōu)選 使用高質(zhì)量的完整RNA作為起始點。RNA的完整性應(yīng)該在一些應(yīng)用中進行檢查，例如定量 RT-PCR、RNA測序、微陣列、核糖核酸酶保護測定、原位雜交、northern印記分析、RNA作圖、 體外翻譯、cDNA文庫構(gòu)建以及任何種類的測序或陣列應(yīng)用。這個問題在具有獨特的或有限 的組織材料（例如，手術(shù)后獲得的組織）的臨床應(yīng)用中尤為重要，其中需要可靠的RNA定 量。
[0004] 迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了很多方法使人們能夠評估目的RNA群體的質(zhì)量以確定其是 否具有足夠的質(zhì)量以用于分析目的。例如，為了確定RNA的純度，可以考慮0D26(lmi/0D28(lnm的 比，但是，該參數(shù)僅提供了蛋白或苯酚污染的信息，而沒有給出關(guān)于RNA完整性的適當(dāng)?shù)暮?充分的信息。幾十年來，確定RNA降解水平的唯一方式是使用基于瓊脂糖凝膠的電泳，但是 這個方法易變、不精確、耗時并且成本高昂。
[0005] 多種評估RNA完整性的方法基于測量相同或不同長度的不同種RNA的數(shù)目或者同 一種RNA的不同片段的數(shù)目，然后得到與RNA完整性有關(guān)的數(shù)。最好的實例是3' :5'方法， 其通過PCR測量由RNA分子3'片段和5'片段的擴增獲得的Cq值并且使用這樣獲得的擴 增子數(shù)目的比值作為RNA完整性的量度。
[0006] 還使用自動化平臺來評估RNA的完整性。目前，兩種自動化系統(tǒng)可以用于這個目 的：Experion(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)和 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，PaloAlto,CA，USA)。這兩種系統(tǒng)都是基于自動化的和微型化的電泳系統(tǒng)， 由芯片實驗室（Lab-on-chip)技術(shù)實現(xiàn)。這兩種平臺通過使用核糖體28S/18S的比或者代 表RNA完整性的數(shù)字系統(tǒng)來確定RNA的質(zhì)量。AgilentTechnologies為2100Bioanalyzer 提供了RIN算法（RNA完整性數(shù)，RNAIntegrityNumber)，而Bio-Rad最近開發(fā)了一種新的 Experion軟件版本，其提供了一種計算RNA質(zhì)量指數(shù)（RQI)的算法。RIN和RQI是基于從1 到10的編號系統(tǒng)，其中1是降解程度最高的RNA譜（RNAprofile)，而10是最完整的RNA 譜。
[0007] 然而，所有上述評估RNA完整性的手段僅提供了順序尺度（ordinalscale)的測 量：雖然它們可以將不同樣品的完整性相對于彼此或外部標(biāo)準進行排列，但是它們提供的 是定性測量而不是真正的定量測量。它們提供的數(shù)值或評估可能足夠指示樣品中RNA的完 整性是否足以允許其進一步分析，但是它們的作用也極大地限制于此目的。需要一種在比 率尺度（ratioscale)上測量RNA完整性的方法，即真正的定量方法，其涉及RNA的結(jié)構(gòu)并 且能夠?qū)δ康腞NA分子的測量與對RNA降解的測量結(jié)合起來以產(chǎn)生對目的RNA分子總數(shù) 的定量測量。迄今為止，還沒有實現(xiàn)這一點的手段。
[0008] 在本發(fā)明的先導(dǎo)工作中，已開發(fā)了一種用于對RNA樣品完整性程度進行定量的方 法。更具體地，根據(jù)核苷酸受損的概率來定量樣品中RNA的完整性。該定量信息可獨立使 用，以及用于根據(jù)降解程度校正隨后得到的RNA表達結(jié)果。
[0009] 因此，本發(fā)明的方法在以下兩個方面都具有大范圍的潛在應(yīng)用：對生物樣品中 RNA本身的完整性進行定量，以及進一步，能夠校正（從而精確定量）特定目的RNA種類的 mRNA表達水平。在依賴對RNA水平（例如mRNA水平）的變化進行分析的診斷和預(yù)后應(yīng)用 方面，本發(fā)明方法的開發(fā)現(xiàn)在使得能夠?qū)崿F(xiàn)以前達不到的精確水平，從而克服了目前存在 的關(guān)于使用之前產(chǎn)生的RNA數(shù)據(jù)的診斷和預(yù)后局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 在整個本說明書和所附權(quán)利要求書中，除非上下文另有要求，否則詞語"包括"及 類似用語如"包含"和"含有"將被理解為意指包含所陳述的整體或步驟或者整體或步驟的 組，但并不排除任何其它的整體或步驟或者整體或步驟的組。
[0011] 如本文所用的術(shù)語"來源于"應(yīng)理解為意指來源于特定物種的具體的整體或整體 的組，但并不一定是直接獲自所述特定來源。另外，本文所用的沒有數(shù)詞限定的表述包括復(fù) 數(shù)對象，除非上下文另有明確指明。
[0012] 除非另有定義，否則本文中所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常理解的具有相同的含義。
[0013] 本發(fā)明的一個方面涉及確定樣品中RNA完整性的定量測量值（quantitative measure)的方法，所述方法包括：
[0014] (i)測定含從參考基因轉(zhuǎn)錄之RNA分子實體（instance)的樣品（至少一些所述實 體被損壞），以確定所述樣品中所述RNA分子的多種片段中每種片段之完整實體的相對或 絕對數(shù)目的定量測量值，所述片段具有各自不同的長度；以及
[0015] (ii)基于所確定的定量測量值和所述片段的各自不同長度之間的關(guān)系，確定所述 樣品中所述RNA分子實體之完整性的定量測量值。
[0016] 在一些實施方案中，所述方法還可包括：
[0017] (iii)對目的RNA進行定量并且使用在步驟（ii)中計算出的完整性的測量值以及 目的RNA相應(yīng)的降解相關(guān)片段（或其衍生物）的長度來校正該結(jié)果。
[0018] 在一些實施方案中，所述方法還可包括：
[0019] (iii)對從標(biāo)準基因轉(zhuǎn)錄之目的基因轉(zhuǎn)錄的RNA進行定量并且用在步驟（ii)中確 定的完整性的測量值以及目的RNA相應(yīng)的降解相關(guān)片段（或其衍生物）的長度來校正該結(jié) 果。
[0020] 在一個相關(guān)的方面中，提供了對目的RNA進行定量的方法，所述方法包括：
[0021] (i)測定含從參考基因轉(zhuǎn)錄之RNA分子實體的樣品（至少一些所述實體是損壞 的），以確定所述樣品中所述RNA分子的多種片段中每種片段之完整實體的相對或絕對數(shù) 目的定量測量值，所述片段具有各自不同的長度；
[0022] (ii)基于所確定的定量測量值和所述片段各自不同的長度之間的關(guān)系，確定所述 樣品中RNA分子實體完整性的定量測量值；
[0023] (iii)對目的RNA進行定量，并且用在步驟（ii)中計算出的完整性的測量值和目 的RNA降解相關(guān)片段的長度校正該結(jié)果。
[0024] 在另一個方面中提供了對樣品中mRNA完整性之測量值進行定量的方法，所述方 法包括：
[0025] ⑴測定含從參考基因轉(zhuǎn)錄之mRNA分子實體的樣品（至少一些所述實體被損 壞），以確定所述樣品中所述RNA分子的多種片段中每種片段之完整實體的相對或絕對數(shù) 目的定量測量值，所述片段具有各自不同的長度；和
[0026] (ii)基于所確定的定量測量