一種原花青素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性死亡的分析方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種原花青素基于活性氧途徑誘導(dǎo)人肝癌細(xì) 胞自瞻性死亡的分析方法和新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的=大疾病之一，肝癌是最常見(jiàn)的成人惡性腫瘤， 其死亡率位居全球癌癥死亡率的第=位，且仍呈上升趨勢(shì)，每年有超過(guò)60萬(wàn)新增病例，依 然是威脅國(guó)人生命的最大疾病之一。預(yù)防或干預(yù)是臨床常用的抑制肝癌惡化或逆轉(zhuǎn)的有效 手段。但作為惡性腫瘤治療主要手段的化療藥物目前仍存在著諸多缺陷，如毒副作用大和 腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性等。近年來(lái)尋求療效好、毒副作用小，通過(guò)多途徑多祀點(diǎn)發(fā)揮抗肝癌 作用的候選藥物成為全世界的重要研究方向。從天然植物中尋找有效、低毒的具有抗腫瘤 作用的活性成分一直是世界抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。
[0003]原花青素（Procyanidins，簡(jiǎn)稱PC)是由兒茶素或表兒茶素聚合而成的一大類酪 類聚合物。該類物質(zhì)具有多種生物活性，W其高效、低毒和高生物利用率而著稱，廣泛存在 于葡萄、山桂、花生、蓮房等蔬菜、水果和堅(jiān)果中，是近年來(lái)研究開(kāi)發(fā)較為廣泛的功能因子， 原花青素作為公認(rèn)的自由基清除劑具有強(qiáng)的抗氧化活性，其抗氧化和清除自由基能力是 VE50倍，Vc20倍，并能預(yù)防80多種因自由基引發(fā)的疾病，如屯、血管系統(tǒng)疾病、降血脂、抗福 射、抗衰老等，此外還有抗炎、抗腫瘤活性等等。
[0004] 我國(guó)板栗栽培歷史悠久，品種資源豐富。其果實(shí)栗子是我國(guó)傳統(tǒng)的農(nóng)副產(chǎn)品，年產(chǎn) 量超過(guò)100萬(wàn)噸，占世界板栗總產(chǎn)量的3/4。但板栗果肉生產(chǎn)和加工過(guò)程中近8. 9-13. 5% 的板栗殼仍主要W燃燒和自然腐爛方式被廢棄，僅有少數(shù)利用板栗殼制備活性炭、培養(yǎng)基、 吸附水中重金屬離子和殺蟲(chóng)劑的文獻(xiàn)報(bào)道。而關(guān)于板栗殼化學(xué)成分研究報(bào)道甚少，更未設(shè) 及板栗中原花青素（procyanidins from chestnut shell，CSPCs)及其抗腫瘤活性的研究。 [000引 自瞻（Auto地agic)是真核細(xì)胞由基因控制的通過(guò)降解其自身的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器 實(shí)行"自我消化"的一系列程序性死亡過(guò)程。自瞻作為普遍而重要的生命現(xiàn)象廣泛參與多 種生理和病理過(guò)程。因自瞻具有促進(jìn)細(xì)胞存活又可誘導(dǎo)細(xì)胞主動(dòng)性死亡的雙重機(jī)制，已引 起國(guó)內(nèi)外腫瘤研究者極大的興趣。自2007年Levine在《化化re》上發(fā)表自瞻與癌一文中 闡述腫瘤治療與自瞻相關(guān)性W來(lái)，自瞻已成為與調(diào)亡并重的抗腫瘤研究熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本部分的目的在于概述本發(fā)明的實(shí)施例的一些方面W及簡(jiǎn)要介紹一些較佳實(shí)施 方式。在本部分W及本申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)摘要和發(fā)明名稱中可能會(huì)做些簡(jiǎn)化或省略W避免使本 部分、說(shuō)明書(shū)摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而該種簡(jiǎn)化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。
[0007] 鑒于上述和/或現(xiàn)有原花青素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自瞻性死亡的分析方法及原花青素 在治療和預(yù)防肝癌方面的應(yīng)用中存在的問(wèn)題，提出了本發(fā)明。
[0008] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種原花青素通過(guò)刺激活性氧誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞自 瞻性死亡的建模分析方法。
[0009] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案；一種 原花青素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自瞻性死亡的分析方法，其包括，
[0010] 原花青素對(duì)肝癌化pG2生長(zhǎng)增殖的抑制作用的分析：
[0011] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的化pG2細(xì)胞經(jīng)膜蛋白酶消化，接種培養(yǎng)2化后，經(jīng)原花青素處理 6~12化，除去培養(yǎng)基并洗漆后，加入MIT解育，結(jié)束后加入DMS0溶解，于酶標(biāo)儀490皿處 測(cè)定吸光度，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率；
[0012] CSPCs誘導(dǎo)化pG2細(xì)胞自瞻的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)的分析；
[0013] 標(biāo)記自瞻細(xì)胞，將化pG2細(xì)胞接種培養(yǎng)解育2化后，用原花青素處理細(xì)胞不同時(shí)間 或用雷帕霉素處理12h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解育比后，于倒置巧光顯微鏡下觀察并巧光定量；
[0014] 透射電鏡觀察自瞻小體的分析：
[0015] 收集各處理組的化pG2細(xì)胞，離屯、，棄上清，分別固定，然后脫水，超薄切片，己酸 雙氧軸和巧樣鉛負(fù)染，于透射電鏡觀察并定量；
[0016] 細(xì)胞的周期分析：
[0017] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期化pG2細(xì)胞接種解育2化后，用原花青素處理細(xì)胞12h，或經(jīng)預(yù)處理 后用原花青素解育，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，加入艦化丙錠染色液避光染色，過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀分析 細(xì)胞DNA含量的變化；
[0018] 細(xì)胞內(nèi)R0S (reactive o;sygen species,高活性氧自由基）分析；
[0019] 細(xì)胞內(nèi)R0S含量采用氧化敏感探針，DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞被R0S氧化成有巧光 2' 7'-dichlorofluorescein，通過(guò)測(cè)定DCF巧光強(qiáng)度即能反映R0S產(chǎn)生的量，將細(xì)胞分別用 原花青素和陽(yáng)性對(duì)照雷帕霉素解育，隨后用原花青素解育，細(xì)胞經(jīng)DCFH-DA處理后，立即于 巧光顯微鏡觀察并定量；
[0020] 線粒體膜電位測(cè)定的分析：
[0021] 線粒體膜電位測(cè)定采用親脂性巧光探針JC-1，在正常細(xì)胞內(nèi)JC-1W聚合體的形 式分布在線粒體內(nèi)，在590nm處會(huì)激發(fā)出紅色巧光，表明高的膜電位，當(dāng)線粒體膜電位下 降，JC-1W單體形式與膜結(jié)合，在530皿處激發(fā)出綠色巧光，因此通過(guò)JC-1的紅光/綠光 強(qiáng)度比可W判斷線粒體膜電位的變化，將HepG2細(xì)胞經(jīng)原花青素處理12h，收獲細(xì)胞，洗漆， 用含有JC-1的完全培養(yǎng)基于37°C解育30min，直接于巧光顯微鏡下觀察并分析；
[0022] 數(shù)據(jù)處理分析：
[0023] 數(shù)據(jù)WX+SD表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，進(jìn)行t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和方差分析，其 中，X代表平均值，SD代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，t代表檢驗(yàn)?zāi)硞€(gè)變量的總體均值和某指定值之間是否 存在顯著性差異。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種原花青素通過(guò)刺激活性氧誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞自瞻 性死亡在治療和預(yù)防肝癌方面的應(yīng)用。
[0025] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案；一種 原花青素通過(guò)刺激活性氧誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞自瞻性死亡在治療和預(yù)防肝癌方面的應(yīng)用，原花 青素低聚體結(jié)構(gòu)式為：
[0026]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種原花青素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性死亡的分析方法，其特征在于：包括， 原花青素對(duì)肝癌HepG2生長(zhǎng)增殖的抑制作用的分析： 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印G2細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，接種培養(yǎng)24h后，經(jīng)原花青素處理6~ 120h，除去培養(yǎng)基并洗滌后，加入MTT孵育，結(jié)束后加入DMSO溶解，于酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定 吸光度，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率； CSPCs誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞自噬的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)的分析： 標(biāo)記自噬細(xì)胞，將IfepG2細(xì)胞接種培養(yǎng)孵育24h后，用原花青素處理細(xì)胞不同時(shí)間或用 雷帕霉素處理12h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后孵育lh后，于倒置熒光顯微鏡下觀察并熒光定量； 透射電鏡觀察自小體的分析： 收集各處理組的H印G2細(xì)胞，離心，棄上清，分別固定，然后脫水，超薄切片，乙酸雙氧 鈾和檸檬鉛負(fù)染，于透射電鏡觀察并定量； 細(xì)胞的周期分析： 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H印G2細(xì)胞接種孵育24h后，用原花青素處理細(xì)胞12h，或經(jīng)預(yù)處理后用 原花青素孵育，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，加入碘化丙錠染色液避光染色，過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞 DNA含量的變化； 細(xì)胞內(nèi)高活性氧自由基分析： 細(xì)胞內(nèi)高活性氧自由基含量采用氧化敏感探針，DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞被高活性氧自由基 氧化成有焚光2' 7' -dichlorofluorescein，通過(guò)測(cè)定DCF焚光強(qiáng)度即能反映高活性氧自由 基產(chǎn)生的量，將細(xì)胞分別用原花青素和陽(yáng)性對(duì)照雷帕霉素孵育，隨后用原花青素孵育，細(xì)胞 經(jīng)DCFH-DA處理后，立即于熒光顯微鏡觀察并定量； 線粒體膜電位測(cè)定的分析： 線粒體膜電位測(cè)定采用親脂性熒光探針JC-1，在正常細(xì)胞內(nèi)JC-1以聚合體的形式 分布在線粒體內(nèi)，在590nm處會(huì)激發(fā)出紅色熒光，表明高的膜電位，當(dāng)線粒體膜電位下降， JC-1以單體形式與膜結(jié)合，在530nm處激發(fā)出綠色熒光，因此通過(guò)JC-1的紅光/綠光強(qiáng)度 比可以判斷線粒體膜電位的變化，將HepG2細(xì)胞經(jīng)原花青素處理12h，收獲細(xì)胞，洗絳，用含 有JC-1的完全培養(yǎng)基于37°C孵育30min，直接于熒光顯微鏡下觀察并分析； 數(shù)據(jù)處理分析： 數(shù)據(jù)以X土SD表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，進(jìn)行t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和方差分析，其中，一X代表平均值，SD代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，t代表檢驗(yàn)?zāi)硞€(gè)變量的總體均值和某指定值之間是否存在 顯著性差異。
2. -種原花青素通過(guò)刺激活性氧誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞自噬性死亡在治療和預(yù)防肝癌方面 的應(yīng)用，其特征在于：原花青素低聚體結(jié)構(gòu)式為：
其中，n= 2~4。
3. 如權(quán)利要求2所述的原花青素通過(guò)刺激活性氧誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞自噬性死亡在治療 和預(yù)防肝癌方面的應(yīng)用，其特征在于：所述原花青素通過(guò)刺激肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生高活 性氧自由基誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。
4. 如權(quán)利要求3所述的原花青素通過(guò)刺激活性氧誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞自噬性死亡在治療 和預(yù)防肝癌方面的應(yīng)用，其特征在于：所述原花青素通過(guò)刺激肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生高活 性氧自由基誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡的過(guò)程中，肝癌細(xì)胞內(nèi)的線粒體也參與了此過(guò) 程。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種原花青素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性死亡的分析方法及應(yīng)用，本發(fā)明采用人肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定原花青素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬死亡的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)ROS(reactive oxygen species，高活性氧自由基)含量，細(xì)胞周期分布，線粒體膜電位測(cè)定。結(jié)果證實(shí)，原花青素能通過(guò)刺激ROS途徑誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬性死亡，并將這一成果應(yīng)用到預(yù)防和治療肝癌之中。
【IPC分類】C12Q1-68, A61P35-00, A61K31-353, G01N21-64, A23L1-29, C12Q1-06
【公開(kāi)號(hào)】CN104774909
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410555717
【發(fā)明人】段玉清, 柯佳佳, 張海暉, 許慧, 蔡梅紅, 何遠(yuǎn)清, 馬海樂(lè)
【申請(qǐng)人】江蘇大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2014年10月17日