用腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6篩選抗腫瘤藥物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種篩選抗腫瘤藥物的方法，特別是設(shè)及一種用腫瘤壞死因子受體相 關(guān)因子6篩選抗腫瘤藥物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Akt(也稱作蛋白激酶B，P?。┦且粋€(gè)在進(jìn)化上高度保守的絲蘇氨酸蛋白激酶，在 人癌中經(jīng)常高度激活。Akt異常激活意味著腫瘤細(xì)胞對(duì)于調(diào)亡誘導(dǎo)的耐受，細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、 代謝的異常增加。Akt在絕大多數(shù)癌癥中存在著過(guò)度激活的情況，暗示著Akt的激活在腫瘤 發(fā)生中的重要角色。關(guān)于Akt被活化后是如何被募集到細(xì)胞膜上的分子機(jī)制，最近，有人報(bào) 道了腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (TRAF6)是一種E3泛素連接酶，可W泛素化修飾Akt,從 而促進(jìn)Akt轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，并被激活。
[0003] 腫瘤，特別是惡性腫瘤的產(chǎn)生嚴(yán)重影響人們的健康，甚至危及人的生命，快速的發(fā) 現(xiàn)抗腫瘤藥物，可W盡可能地減少腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，特別是一些副作用少的抗腫瘤藥物， 更是目前亟需的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種用腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6篩選抗腫瘤藥物的方 法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0006] 用腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (TRAF6)篩選抗腫瘤藥物的方法，包括如下步驟： WSEQIDNO. 1所示的TRAro作為檢測(cè)祀點(diǎn)的活性口袋，與天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)或商用小分子 數(shù)據(jù)庫(kù)中的小分子，利用AUT0D0CK軟件進(jìn)行活性口袋與小分子的對(duì)接，分析對(duì)接結(jié)果，根 據(jù)打分指標(biāo)預(yù)測(cè)小分子與活性口袋的親和力大小，篩選具有潛在抗腫瘤活性的小分子，通 過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小分子的抗腫瘤活性。
[0007] 所述小分子為奎寧、奎寧了或辛可寧。
[000引本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0009] 針對(duì)在癌癥中高表達(dá)的激酶，選擇令其活化的關(guān)鍵酶，確定藥物的作用祀點(diǎn)，快速 篩選出副作用少、抗腫瘤療效高的小分子抗腫瘤藥物。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1 (A)是（1S)-嗟咐-4-基巧-己締基奎寧-2-基）甲醇（辛可寧）的分子結(jié) 構(gòu)式及其與TRAro的結(jié)合位點(diǎn)；炬）是（1時(shí)-(6-甲氧基嗟咐-4-基）（（1S，4S，5時(shí)-5-己締 基奎寧-2-基）甲醇（奎寧）的分子結(jié)構(gòu)式及其與TRAF6的結(jié)合位點(diǎn)；（C)為（S)-化-甲 氧基嗟咐-4-基）（（1S，2R，4S，5時(shí)-5-己締基奎寧-2-基）甲醇（奎寧了）的分子結(jié)構(gòu)式 及其與TRAF6的結(jié)合位點(diǎn)。
[0011] 圖2辛可寧（圖中A)、奎寧（圖中B)、奎寧了（圖中C)對(duì)子宮頸癌細(xì)胞系化la 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，加藥后（a) 72小時(shí)化），（b)96h，用MIT法測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。
[0012] 圖3辛可寧（圖中A)、奎寧（圖中B)、奎寧了（圖中C)對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)-549細(xì)胞 的生長(zhǎng)抑制作用，加藥后（a) 7化，（b)96h，用MIT法測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。
[0013] 圖4培養(yǎng)化la細(xì)胞添加不同濃度化合物后4她，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV和 PI的表達(dá)（a)辛可寧，化）奎寧和（C)奎寧了誘導(dǎo)細(xì)胞早期調(diào)亡的作用。
[0014] 圖5培養(yǎng)A549細(xì)胞的Bax/Bcl的表達(dá)，（a)加奎寧1化、2化、4她、7化和96h后， 化）（a)圖中的條帶用ImageJ軟件（NationalInstitutesofHealth)半定量測(cè)定后，計(jì)算 Bax/ 0 -actin和Bel/ 0 -actin的比值用柱狀圖表示。
[00巧]圖6加1. 5Xl(T4mol/L的奎寧分別刺激3、6、12和2化，再加20yg/ml的LPS刺激 化后，Westernblot法測(cè)定磯酸化Akt(pAkt)的結(jié)果，柱狀圖是用ImageJ軟件Optional InstitutesofHealth)半定量測(cè)定pAkt和P-actin的條帶（a)為A-549 細(xì)胞（b)為 化la細(xì)胞
[0016] 圖7培養(yǎng)化la細(xì)胞加化合物奎寧作用3, 6, 12, 2化后，提取蛋白質(zhì)用TRAro抗體 進(jìn)行免疫共沉淀后檢測(cè)Akt表達(dá)，（a)五個(gè)條帶分別為；1 ;空白對(duì)照；2,加奎寧后化；3 ;加 奎寧后化；4 ;加奎寧后12h;5 ;加奎寧2化；化）用ImageJ軟件OptionalInstitutesof Health)半定量測(cè)定Akt和TRAro的條帶，柱狀圖表示Akt/TRAro的比值。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。本發(fā)明的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域 的技術(shù)人員能夠?qū)嵤⒉粚?duì)本發(fā)明作任何限制。其中的常用試劑的公開(kāi)了是為了使本 領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的實(shí)施本發(fā)明，但并不對(duì)本發(fā)明作任何限制。
[001引 實(shí)施例1
[0019] 用計(jì)算機(jī)模擬篩選技術(shù)，篩選出TRAro相關(guān)小分子化合物：
[0020] 蛋白結(jié)構(gòu)信息獲??；從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載TRAro蛋白結(jié)構(gòu)（PDBID;3肥T) 用SEQIDNO. 1所示，W其作為檢測(cè)祀點(diǎn)的活性口袋；將天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)或商用小分子數(shù)據(jù) 庫(kù)中的小分子，進(jìn)行對(duì)接前的加氨，加電荷等處理；利用AUT0D0CK軟件進(jìn)行活性口袋與小 分子的對(duì)接，分析對(duì)接結(jié)果，根據(jù)打分指標(biāo)預(yù)測(cè)小分子與活性口袋的親和力大小，并分析各 種參數(shù)的相互關(guān)系及對(duì)結(jié)合能的貢獻(xiàn)，篩選具有潛在抗腫瘤活性的小分子奎寧、奎寧了和 辛可寧（圖1)。
[002。TRAF6是有523個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)的細(xì)胞內(nèi)泛素酶，我們選擇TRAF6為作用祀點(diǎn)，首先 用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)找到能夠與泛素結(jié)合酶結(jié)合位點(diǎn)（即TRAro的第50-80,90-110氨基酸） 結(jié)合的小分子化合物，合成或購(gòu)買其中幾種化合物后，測(cè)試其抗腫瘤活性及作用的分子機(jī) 制。
[0022] 用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)找到能夠與TRAF6的第50-80,90-110氨基酸的2個(gè)W上氨基 酸結(jié)合的小分子化合物，建立化合物作用祀點(diǎn)；
[0023] 分別檢測(cè)幾種化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，和誘發(fā)細(xì)胞調(diào)亡的作用；
[0024] 實(shí)施例2
[00巧]實(shí)施例1篩選的化合物奎寧、奎寧了和辛可寧對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：
[0026]培養(yǎng)化la細(xì)胞和A-549細(xì)胞（購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司），W4000個(gè)/孔 的細(xì)胞密度接種到96孔板，培養(yǎng)24小時(shí)化）后，分別加入1X1(T6, 5X10^5,1X10^5, 5Xi(T4， 1X1〇-4, 2. 5X1〇-4, 5Xl〇-4mol/L濃度的奎寧、奎寧了或者辛可寧，分別培養(yǎng)4她，72h和96h 后用MIT法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，其結(jié)果總結(jié)為圖2和圖3,圖2顯示3種化合物都能有濃度依 存性地抑制化la細(xì)胞的生長(zhǎng)，圖3顯示3種化合物都能有濃度依存性地抑制A-549細(xì)胞的 生長(zhǎng)。圖中A、B、C各代表辛可寧（A)、奎寧炬）、奎寧了（C)。
[0027]MIT法：每孔加入5mg/ml的MIT溶液20y1，培養(yǎng)箱中解育化后取出，棄去上清， 每孔加150y1二甲基亞諷溶解甲瑣沉淀，用酶標(biāo)儀在490nm下測(cè)定吸光度值。
[0028] 圖2、3為加入化合物后72和9化的細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)并W柱狀圖表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明3種化合物都可W抑制Hela細(xì)胞（圖2)和A-549細(xì)胞（圖3)的生長(zhǎng)，表明3種化合 物都有抗腫瘤活性。
[002引實(shí)施例3
[0030] 早期細(xì)胞調(diào)亡的檢測(cè)--流式細(xì)胞
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