根際促生菌及其應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)微生物領域，具體地說是一種根際促生菌及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥為禾本科植物，世上分布最廣糧食作物，播種面積為糧食作物之冠。2010年， 其在世界上總產(chǎn)量達6. 51億噸，僅次于玉米的8. 44億噸。同時小麥是中國最重要的口糧 之一，主要產(chǎn)于河南、山東、江蘇、河北、湖北、安徽等省，小麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展直接關系到國家糧食 安全和社會穩(wěn)定。然而，在我國科學技術(shù)對此作物的提高作用遠低于種植面積的減少幅度。
[0003] 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，化肥的使用提高了小麥產(chǎn)量，然而也向環(huán)境釋放了大量的有害物 質(zhì)，污染了土壤、水源以及食品本身，對人類健康及生存環(huán)境也構(gòu)成了極大威脅。因此，適應 綠色農(nóng)業(yè)以及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需求，開發(fā)利用替代化學肥料的新肥源成為當務之急。
[0004] 根際促生菌是自由生活在根圍土壤或附生于根表、根內(nèi)的可促進植物生長及其對 礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類。根際促生菌可以通過一種或多種 機制直接或間接的促進植物生長。通過固氮、解磷、解鉀、產(chǎn)植物激素、酶解降低乙烯等作 用，增加土壤養(yǎng)分，促進根系對礦質(zhì)的吸收利用，直接刺激和調(diào)節(jié)植物生長；另一方面，通過 產(chǎn)生抗生素和分泌鐵載體、HCN等物質(zhì)，其可以抑制土壤中有害病原微生物，間接的保護和 促進植物生長。接種根際促生菌，不但能夠減少化肥農(nóng)藥的使用，也能減輕因大量使用化肥 農(nóng)藥而造成的環(huán)境污染和食品安全問題。自1990第四屆國際植物細菌年會上Keleopper 等人在法國召開的做了有關根際促生菌的報告后，應用根際促生菌促進植物生長，提高農(nóng) 作物產(chǎn)量的研宄再次引起人們的極大關注。目前，人們已經(jīng)從玉米、小麥、苜蓿、甘蔗、水稻 及多種牧草等的根際中，篩選到多種具有優(yōu)良特性的促生菌株，在溫室和田間接種試驗中 取得良好的促生效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種根際促生菌及其應用。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種根際促生菌，根際促生菌為根際促生菌N10,其分類命名為生癌腸桿菌 (Enterobacter cancerogenus)，于2015年3月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心（CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 1. 14969,保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所。
[0008] -種根際促生菌的應用，所述根際促生菌應用于促進植物生長中。
[0009] 進一步的說，所述根際促生菌應用于促進小麥生長中。
[0010] 更進一步的說，所述根際促生菌應用于促進小麥生長中，作為接種劑（促生劑）或 微生物菌肥。
[0011] 具體是，將OD6c?為0. 8的經(jīng)LB培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)的Iml生癌腸桿菌液（根際促生 菌N10)作為作為接種劑（促生劑）或微生物菌肥噴在發(fā)芽的小麥種子表面，溫室下培養(yǎng)， 進而促進小麥生長；
[0012] 其中，小麥種子是經(jīng)浸泡后溫育發(fā)芽的小麥種子轉(zhuǎn)移種于滅菌的拌有低氮-磷酸 媽培養(yǎng)液中；
[0013] 所述滅菌的拌有低氮-磷酸鈣培養(yǎng)液承裝于蛭石的雙層缽中；
[0014] 所述低氮-磷酸媽培養(yǎng)液成分：去離子水1L，梓檬酸鐵（ferric citrate) 0. 075g， Ca(NO3)20.0 3g, KCl 0· 075g，MgSO4 · 7H20 0· 06g，Ca3 (PO4) 25g, CaSO4 0· 46g，微量元素 ImL ;
[0015] 所述微量元素組分：去離子水 1L，H3B032.86g，MnSO4L 81g，CuSO4 · 5H200.8g， ZnSO4O. 22g, H2MoO40.0 2g，pH 至 7· 0。
[0016] 所述室溫培養(yǎng)的條件為溫度控制在26±2°C，光照周期12h:12h。
[0017] 上述所述雙層缽設計：上層為透明塑料杯盛蛭石，下層為寬口玻璃瓶盛滅菌水，塑 料杯底部開孔，一根粗棉芯穿過開孔，上部埋在蛭石中央，下部伸到無菌水中。
[0018] 其中菌株可用于制備促進小麥生長的微生物接種劑。
[0019] 所述菌株可用于制備微生物菌肥，其有使固氮、溶磷、產(chǎn)吲哚乙酸能力，能增加土 壤含氮量，提高土壤營養(yǎng)有效性，減少化肥施用量。
[0020] 具體是，菌株能夠?qū)⒖諝庵械牡獨膺€原成氨態(tài)氮，具有自生固氮能力。
[0021] 菌株具有強的溶磷能力，能將磷酸鈣轉(zhuǎn)化成易于被植物吸收的可溶性磷酸鹽。
[0022] 菌株能夠合成和分泌吲哚乙酸。
[0023] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0024] 本發(fā)明根際促生菌具有固氮、解磷、產(chǎn)吲哚乙酸的促生特性，可以增加土壤養(yǎng)分， 提高肥料有效性，促進植物對土壤養(yǎng)分吸收，具有開發(fā)成促進農(nóng)作物生長的微生物接種劑 或微生物菌肥。其固氮能力達16.36nmol(C2H2mg 4protein IT1);搖床溫育培養(yǎng)下，其10 天后磷酸鈣轉(zhuǎn)化量比不接菌的空白對照高出254. 58mg L-1，吲哚乙酸60h后產(chǎn)量1. 10 μ g ml 1O
[0025] 進而所獲得菌株對小麥具有顯著的促生效果，菌株良好地促生特性促進了小麥地 上部的生長。接入菌株的小麥地上部干重增長60. 87%，鮮重增長57. 14%，均達到統(tǒng)計學 的顯著水平，并且沒有可見的病變表征。另外，在營養(yǎng)相對缺乏的培養(yǎng)環(huán)境下，該根際促生 菌能顯著地促進小麥的生長。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實施例提供的根際促生菌NlO在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1天上的菌落形態(tài)。
[0027] 圖2為本發(fā)明實施例提供的根際促生菌NlO在PVK固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5天解磷透明 圈。
[0028] 圖3為本發(fā)明實施例提供的溫室培養(yǎng)50天后，接菌小麥與不接菌小麥生長狀況對 比及雙層缽展示照片。
[0029] 圖4為本發(fā)明實施例提供的溫室培養(yǎng)50天后，接菌小麥與不接菌小麥干重對比 圖。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1
[0031] 菌株的鑒定
[0032] 將根際促生菌NlO在LB培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)，觀察菌落特征：菌落頂 部平，凸起，半透明，乳白色，表面較濕潤。
[0033] 所述根際促生菌為根際促生菌N10,其分類命名為生癌腸桿菌（Enterobacter cancerogenus)，于2015年3月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心（CGMCC)，保藏號為 CGMCC No. 1. 14969。
[0034] 挑取菌落收集菌體，用天根細菌基因組DNA提取試劑盒，依據(jù)內(nèi)附說明書提取所 述菌株基因組DNA，保存于-20 °C冰箱備用。
[0035] 16S rRNA gene PCR:
[0036] ①引物 27F :AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG，1492R :TACGGCTACCTTGTTACGACTT。
[0037] ②反應體系：25uL天根PCR Mix，IuL引物27F，luL1492R引物，IuL提取的DNA， 22uL滅菌超純水。
[0038] ③PCR反應條件為：95°C變性5min ;94°C變性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸 lmin，從第二步開始30個循環(huán).PCR產(chǎn)物序列測定委托上海生工生物技術(shù)有限公司完成，參 見序列表SEQ ID No. 1。
[0039] 序列表 SEQ ID No. 1
【主權(quán)項】
1. 一種根際促生菌，其特征在于：根際促生菌為根際促生菌N10,其分類命名為生癌腸 桿菌（Enterobacter cancerogenus)，于2015年3月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 1. 14969。
2. -種權(quán)利要求1所述的根際促生菌的應用，其特征在于：所述根際促生菌應用于促 進植物生長中。
3. 按權(quán)利要求2所述的根際促生菌的應用，其特征在于：所述根際促生菌應用于促進 小麥生長中。
4. 按權(quán)利要求3所述的根際促生菌的應用，其特征在于：所述根際促生菌應用于促進 小麥生長中，作為接種劑（促生劑）或微生物菌肥。
5. 按權(quán)利要求4所述的根際促生菌的應用，其特征在于：將OD _為0. 8的經(jīng)LB培養(yǎng)基 中馴化培養(yǎng)的Iml生癌腸桿菌液（根際促生菌N10)作為作為接種劑（促生劑）或微生物 菌肥噴在發(fā)芽的小麥種子表面，溫室下培養(yǎng)，進而促進小麥生長； 其中，小麥種子是經(jīng)浸泡后溫育發(fā)芽的小麥種子轉(zhuǎn)移種于滅菌的拌有低氮-磷酸鈣培 養(yǎng)液中。
6. 按權(quán)利要求5所述的根際促生菌的應用，其特征在于： 所述滅菌的拌有低氮-磷酸鈣培養(yǎng)液承裝于蛭石的雙層缽中； 所述低氮-磷酸1?培養(yǎng)液成分：去離子水1L，梓檬酸鐵（ferric citrate)0. 075g， Ca(NO3)2 0.03g, KCl 0.075g，MgSO4 .7H20 0.06g，Ca3(PO4)2 5g, CaSO4 0.46g，微量元素 ImL ； 所述微量元素組分：去離子水 1L，H3BO3 2. 86g，MnSO4 I. 81g，CuSO4 ? 5H20 0? 8g，ZnSO4 0? 22g, H2MoO4 0? 02g，pH 至 7. 0。
7. 按權(quán)利要求5所述的根際促生菌的應用，其特征在于：所述室溫培養(yǎng)的條件為溫度 控制在26±2°C，光照周期12h:12h。
【專利摘要】本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)微生物領域，具體地說是一種根際促生菌及其應用。根際促生菌為根際促生菌N10，其分類命名為生癌腸桿菌(Enterobacter cancerogenus)，于2015年3月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.1.14969。本發(fā)明菌株具有固氮、解磷、產(chǎn)吲哚乙酸的促生特性，可以增加土壤養(yǎng)分，提高肥料有效性，促進植物對土壤養(yǎng)分吸收，具有開發(fā)成促進農(nóng)作物生長的微生物接種劑或微生物菌肥的良好前景。本發(fā)明針對小麥具有顯著的促生效果，菌株良好地促生特性促進了小麥地上部的生長。CGMCC No. 1.1496920150325
【IPC分類】C12N1-20, C05F11-08
【公開號】CN104805045
【申請?zhí)枴緾N201510224643
【發(fā)明人】解志紅, 李項岳, 李巖, 宮江峰, 姜楠
【申請人】中國科學院煙臺海岸帶研究所
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月5日