一種產(chǎn)高純度2-酮基-d-葡萄糖酸的粘質(zhì)沙雷氏菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及一種產(chǎn)高純度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘質(zhì)沙雷 氏菌株。
【背景技術(shù)】
[0002] 2-酮基-D-葡萄糖酸（2-keto-D-gluconic acid，2KGA)是葡萄糖酸的一種重要衍 生物。2-酮基-D-葡萄糖酸可作為飼料的富鈣添加劑、洗滌劑的促凈劑、水機(jī)增塑劑和攝影 顯影劑等。同時，2-酮基-D-葡萄糖酸還是合成糠醛、D-阿拉伯糖、D-異抗壞血酸及D-異 抗壞血酸鈉的前體。其中合成D-異抗壞血酸(鈉）是其最主要的用途。
[0003] 異抗壞血酸為白色至淺黃色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭，味酸，具有極強(qiáng)的還原性， 極易溶于水，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織、建材、日用化工等行業(yè)，其中，最主要用途是應(yīng)用 于食品加工行業(yè)。由于目前異抗壞血酸(鈉）在天然食品中不存在，市場上的產(chǎn)品均為人工 合成產(chǎn)品。目前異抗壞血酸生產(chǎn)主要是利用2-酮基-D-葡萄糖酸經(jīng)酯化、轉(zhuǎn)化、精制等過 程得到成品。
[0004] 2-酮基-D-葡萄糖酸的生產(chǎn)方法主要有酶法、化學(xué)合成法和發(fā)酵法等三 種：（1)酶法。在在P比喃糖-2-氧化酶（pyranose-2-oxidase)、葡萄糖-2-氧化酶 (glucose-2-oxidase)和葡萄糖-1-氧化酶（glucose-1-oxidase)中任何一種酶的催化下， 用〇 2將溶液中的D-葡萄糖氧化為D-葡糖醛酮或D-葡萄糖酸-S -內(nèi)醋，然后選擇吡喃 糖-2-氧化酶和葡萄糖-1-氧化酶的一種酶，催化氧化D-葡糖醛酮或D-葡萄糖酸-S -內(nèi) 酯為過氧化氫和2-酮基-D-葡萄糖酸；（2)化學(xué)合成法。以葡萄糖為起始原料，在Pt/Pb催 化劑存在的條件下，用〇 2將葡萄糖氧化為2-酮基-D-葡萄糖酸；(3)發(fā)酵法。利用細(xì)菌直接 轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖為2-酮基-D-葡萄糖酸(魏轉(zhuǎn)，余泗蓮，劉正安，孫文敬，周強(qiáng)， 李中兵。2-酮基-D-葡萄糖酸發(fā)酵生產(chǎn)研宄進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2008,29(8):636-639)。
[0005] 由于生產(chǎn)成本、生產(chǎn)安全性等方面的原因，目前在工業(yè)生產(chǎn)中通常采用細(xì)菌發(fā)酵 的方法。目前，國外對于發(fā)酵法生產(chǎn)發(fā)酵法2-酮基-D-葡萄糖酸的研宄菌屬主要是食爬蟲 假單胞菌、歐文氏菌、沙雷氏菌、葡萄糖酸桿菌、醋酸桿菌，工業(yè)生產(chǎn)菌株主要是熒光假單胞 菌、粘質(zhì)沙雷氏菌和雞血藤歐文氏菌。國內(nèi)對于發(fā)酵法生產(chǎn)發(fā)酵法2-酮基-D-葡萄糖酸的 研宄菌屬主要是熒光假單胞菌(余泗蓮，汪美生，孫文敬，崔鳳杰，魏轉(zhuǎn)，余斌，周強(qiáng)，齊向輝， 王亮.熒光假單胞菌JD1202利用大米淀粉水解糖連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸[J]. 中國食品添加劑，2012, 6:191-197.)、沙雷氏菌、球狀節(jié)桿菌、惡臭假單胞菌、產(chǎn)酮產(chǎn)堿菌， 工業(yè)生產(chǎn)菌株主要是熒光假單胞菌和球狀節(jié)桿菌。生產(chǎn)菌株的轉(zhuǎn)化率一般在90%左右。
[0006] 雖然發(fā)酵法是目前2-酮基-D-葡萄糖酸生產(chǎn)的主要方法，但是由于現(xiàn)用生產(chǎn)菌的 原料利用率不高，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率偏低，產(chǎn)品純度較低，生產(chǎn)損耗大，且容易被噬菌體污染，因此 有必要篩選具有轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品純度高、發(fā)酵速率快等優(yōu)良特性的新2-酮基-D-葡萄糖酸 生產(chǎn)菌，以取代或部分取代目前的生產(chǎn)菌，從而提高生產(chǎn)效率，降低成產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決現(xiàn)有技術(shù)發(fā)酵法生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸中由于菌種問題導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低、 純度低、生產(chǎn)損耗大且易被噬菌體污染的問題，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)高純度2-酮基-D-葡 萄糖酸的粘質(zhì)沙雷氏菌株。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案為： 產(chǎn)高純度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)SDSPY_136菌 株，該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No :10548,其保藏時間為：2015年2月9日。
[0009] 所述的產(chǎn)高純度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens) SDSPY-136菌株，其獲取步驟為：1)由土樣中的微生物經(jīng)培養(yǎng)、篩選獲得出發(fā)菌株，S卩，粘質(zhì) 沙雷氏菌（Serratia marcescens) S-136 ;2)將出發(fā)菌株接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)誘變、 篩選獲得耗糖速率穩(wěn)定、2-酮基-D-葡萄糖酸產(chǎn)量及純度都有提高的突變菌株SD-136 ;3) 將突變菌株SD-136接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)誘變、篩選、復(fù)篩，獲得遺傳性質(zhì)穩(wěn)定、2-酮 基-D-葡萄糖酸產(chǎn)量最高達(dá)104.6g/L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)95. 1%的突變菌株SDSPY-136。
[0010] 進(jìn)一步的，步驟1)中由土樣中的微生物經(jīng)富集培養(yǎng)、溴甲酚紫-碳酸鈣篩選平板 篩選、斜面培養(yǎng)后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，篩選獲得產(chǎn)高純2-酮基-D-葡萄糖酸的出發(fā)菌株，命 名為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens) S-136 ;步驟2)中，出發(fā)菌株對數(shù)生長中期的 菌體，做成細(xì)胞濃度為IX 108 - 10 9cfu/ml的菌懸液，在紫外燈照射下誘變，間隔挑取不同 紫外燈照射時間的樣品，進(jìn)行溴甲酚紫-碳酸鈣篩選平板篩選、斜面培養(yǎng)后，發(fā)酵篩選，獲 得突變菌株SD-136 ;步驟3)中，突變菌株SD-136對數(shù)生長中期的菌體，做成細(xì)胞濃度為 1 X 108 - 10 9cfu/ml的菌懸液，在亞硝基胍處理液的作用下誘變，間隔挑取不同處理時間的 樣品，進(jìn)行平板篩選、斜面培養(yǎng)后，發(fā)酵篩選；發(fā)酵篩選的菌株進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩，獲得突變菌株 SDSPY-136。
[0011] 該保藏菌株的生物學(xué)特征是：在固體培養(yǎng)(分離培養(yǎng)基)平板上30°C培養(yǎng)24h后觀 察，菌落可形成紅色、表面光滑濕潤的圓形菌落，微凸起，光學(xué)顯微鏡下觀察菌體為近球形 短桿狀，革蘭氏染色呈陰性，無芽孢。用于菌體形態(tài)觀察的固體培養(yǎng)基組成（g/L):蛋白胨 5,氯化鈉5,牛肉膏3,瓊脂18，pH值7. 0。上述形態(tài)特征觀測的實(shí)驗方法參考東秀珠、蔡妙 英等編著的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，科學(xué)出版社，2001，第一版，p353-363。
[0012] 所述的產(chǎn)高純度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens) SDSPY-136菌株，能利用葡萄糖和海藻糖作為碳源，不發(fā)酵阿拉伯糖，葡萄糖發(fā)酵不產(chǎn)氣體， 觸酶陽性。
[0013] 該菌株生理生化試驗培養(yǎng)基及實(shí)驗方法參考東秀珠、蔡妙英等編著的《常見細(xì)菌 系統(tǒng)鑒定手冊》，科學(xué)出版社，2001，第一版，p364-398。菌株CGMCCN0. 10584生理生化實(shí)驗 結(jié)果詳見表1。
【主權(quán)項】
1. 產(chǎn)高純度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)SDSPY_136 菌株，該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為 CGMCC No : 10548,其保藏時間為：2015年2月9日。
2. 如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)高純度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)SDSPY-136菌株，其特征在于，其獲取步驟為：1)由土樣中的微生物經(jīng)培養(yǎng)、篩 選獲得出發(fā)菌株，即，粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)S_136 ;2)將出發(fā)菌株接種于種 子培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)誘變、篩選獲得耗糖速率穩(wěn)定、2-酮基-D-葡萄糖酸產(chǎn)量及純度都有提高 的突變菌株SD-136 ;3)將突變菌株SD-136接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)誘變、篩選、復(fù)篩，獲 得遺傳性質(zhì)穩(wěn)定、2-酮基-D-葡萄糖酸產(chǎn)量最高達(dá)104. 6g/L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)95. 1%的突變菌 株 SDSPY-136。
3. 如權(quán)利要求2所述的產(chǎn)高純度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens) SDSPY-136菌株，其特征在于：步驟1)中由土樣中的微生物經(jīng)富集培養(yǎng)、溴甲 酚紫-碳酸鈣篩選平板篩選、斜面培養(yǎng)后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，篩選獲得產(chǎn)高純2-酮基-D-葡 萄糖酸的出發(fā)菌株，命名為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens) S-136 ;步驟2)中，出發(fā) 菌株對數(shù)生長中期的菌體，做成細(xì)胞濃度為I X IO8 - 10 9cfu/ml的菌懸液，在紫外燈照射下 誘變，間隔挑取不同紫外燈照射時間的樣品，進(jìn)行溴甲酚紫-碳酸鈣篩選平板篩選、斜面培 養(yǎng)后，發(fā)酵篩選，獲得突變菌株SD-136 ;步驟3)中，突變菌株SD-136對數(shù)生長中期的菌體， 做成細(xì)胞濃度為IX IO8 - l〇9cfu/ml的菌懸液，在亞硝基胍處理液的作用下誘變，間隔挑取 不同處理時間的樣品，進(jìn)行平板篩選、斜面培養(yǎng)后，發(fā)酵篩選；發(fā)酵篩選的菌株進(jìn)行發(fā)酵復(fù) 篩，獲得突變菌株SDSPY-136。
4. 如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)高純度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serrat