一種基于Taqman探針檢測揚子鱷的實時熒光定量PCR引物、試劑盒及方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物技術領域，具體涉及一種特異性檢測揚子鱷成分的熒光定量 PCR試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 揚子鱷（Alligator sinensis)或稱作鼉（tu0)，是中國特有的一種鱷魚，是世界 上最小的鱷魚品種之一。它既是古老的，又是現(xiàn)存數(shù)量非常稀少、世界上瀕臨滅絕的爬行動 物。因其生活在長江流域，故稱"揚子鱷"。在揚子鱷身上，至今還可以找到早先恐龍類爬行 動物的許多特征。所以，人們稱揚子鱷為"活化石"。因此，揚子鱷對于人們研宄古代爬行動 物的興衰和研宄古地質(zhì)學和生物的進化，都有重要意義。揚子鱷屬于爬行動物綱鱷目短吻 鱷科動物，該科有4屬8種，僅揚子鱷在中國有分布。
[0003] 揚子鱷全身都是寶，它的肉曾是宴席上的佳肴，它的皮是制造高檔革制品的上好 材料，它還具有很高的藥用價值，因此遭到人們的亂捕濫殺。又因為揚子鱷是一種肉食性動 物，能在圩堤上挖穴打洞，因此農(nóng)民曾把它當作有害動物，見了就捕殺。揚子鱷已處于幾乎 要絕滅的境地。
[0004] 為此，我國政府于1972年將揚子鱷列為國家一級保護動物，1973年瀕危野生動植 物國際貿(mào)易公約將它列入重點保護動物名錄，禁止貿(mào)易。1981年，據(jù)專家估計，野外生存的 揚子鱷僅有300-500條，這一物種可能在10年內(nèi)絕滅。中國已經(jīng)把揚子鱷列為國家一級保 護動物，嚴禁捕殺。為了使這種珍貴動物的種族能夠延續(xù)下去，中國還在安徽、浙江等地建 立了揚子鱷的自然保護區(qū)和人工養(yǎng)殖場。
[0005] 為了更有效地保護揚子鱷，需要對市場上的皮制品進行監(jiān)測。因此，本專利建立一 種基于taqman探針的揚子鱷制品實時焚光定量PCR特異性鑒定方法。
[0006] 實時 RT-PCR (real time RT-PCR，RRT-PCR)又稱 TaqMan PCR。RRT-PCR 檢測禽 流感快速、敏感、特異，由于其不僅采用了特異性引物，而且采用了特異性探針，使該方法 的特異性高于傳統(tǒng)PCR，大大減少了非特異性擴增造成的假陽性結(jié)果。全封閉反應的熒光 RT-PCR技術是通過計算機記錄并分析PCR過程中產(chǎn)生的熒光信號，實現(xiàn)了對PCR擴增過程 實時監(jiān)測，無需電泳檢測，徹底杜絕了 PCR產(chǎn)物的氣溶膠污染和EB對環(huán)境的污染。應用一 步法RT-PCR和熒光水解探針，用于檢測A型禽流感，其敏感度很高，可達10 fg (約100個） 的靶RNA分子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種特異性檢測揚子鱷成分的熒光定量PCR試劑盒及檢 測方法。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術方案是： 一種檢測揚子鱷的實時熒光定量PCR引物，其序列為： AS-F :5' - CTTACACACAACTAAACAGCAACCG -3'（SEQ ID NO. 1)， AS-R:5' - GAAGAAGTCTAGGACGAGGGCC -3' （SEQ ID ΝΟ·2)。
[0009] -種檢測揚子鱷的實時熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有上述所述的引物。
[0010] 進一步的，上述試劑盒還含有實時熒光定量PCR檢測探針，其序列如為： AS-P :5' - CAACACGCCCCATGTCTCAGCTCC -3' （SEQ ID N0.3)。
[0011] 一種檢測揚子鱷的實時熒光定量PCR方法，該方法包括以下步驟： 1) 待測樣品的DNA提?。?2) 熒光定量PCR擴增： 反應體系：每25 μ 1反應體系中含有：PCR Mix 20 μ I、Taq酶?μL，待檢測的DNA 4μ1 ; 其中每50mL PCR Mix的配方如下：
【主權項】
1. 一種檢測揚子鱷的實時熒光定量PCR引物，其序列為： AS-F :5' - CTTACACACAACTAAACAGCAACCG -3'（SEQ ID NO. 1)， AS-R:5' - GAAGAAGTCTAGGACGAGGGCC -3' （SEQ ID N0.2)。
2. -種檢測揚子鱷的實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：該試劑盒含有權利要求1 所述的引物。
3. 根據(jù)權利要求2所述的一種檢測揚子鱷的實時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于： 該試劑盒還含有實時熒光定量PCR檢測探針，其序列如為： AS-P:5' - CAACACGCCCCATGTCTCAGCTCC -3' （SEQ ID N0.3)。
4. 一種檢測揚子鱷的實時熒光定量PCR方法，其特征在于：該方法包括以下步驟： 1) 待測樣品的DNA提??； 2) 熒光定量PCR擴增： 反應體系：每25 μ 1反應體系中含有：PCR Mix 20 μ I、Taq酶?μL，待檢測的DNA 4μ1 ; 其中每50mL PCR Mix的配方如下：
反應體系條件：ABI PRISM 7300/7500、MJ Opticon等儀器循環(huán)條件為94°C 2分鐘， 94°C 15秒，55°C 30秒，40個循環(huán)；LightCycler等使用毛細管的儀器循環(huán)條件為93°C 2 分鐘，93 °C 5秒，58 °C 45秒，共40個循環(huán)； 3) 結(jié)果分析： 陽性：檢測樣本Ct值小于等于35. 0,且曲線有明顯的指數(shù)增長期； 可疑：檢測樣本Ct值大于35. 0且小于40. 0,重復一次實驗，如果Ct值仍小于40. 0,且 曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性； 陰性：檢測不到樣本Ct值或Ct值為40 ; 上述檢測方法用于非疾病檢測和診斷。
5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于：所述待測樣品DNA提取的具體操作為： 固體組織：取0. 5g左右組織用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入I. 5ml生理鹽水繼續(xù) 研磨，待勾衆(zhòng)后轉(zhuǎn)至I. 5ml的EP管中，1000 Orpm離心2min，取上清200 μ 1于I. 5ml的EP 管中，加入200 μ 1核酸提取液充分震蕩； 血液標本：取100 μ 1血液加入100 μ 1核酸提取液，充分震蕩，KKTC水浴10min，4°C條 件下13, OOOrpm離心5min，吸取上清液即為提取的DNA。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于Taqman探針檢測揚子鱷的實時熒光定量PCR引物、試劑盒及方法，本發(fā)明的檢測方法及試劑盒操作簡便快速，特異性高，檢測效果敏感、可靠，最低檢測濃度為1×101拷貝/μl。能夠?qū)崿F(xiàn)對市場上的皮制品進行快速檢測，應用極為方便。由于引入了特異性擴增引物和熒光探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強，從而避免了其他檢測方法特異性不高、無法判定制品中是否含有揚子鱷成分的缺點?；谏鲜鰞?yōu)點，該試劑盒適合在各級野生動物保護組織、市場監(jiān)管部門和各種出入境機構(gòu)等進行推廣應用，具有廣泛的應用前景。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104862311
【申請?zhí)枴緾N201510223933
【發(fā)明人】張曉瑋, 徐貴峰, 鄧武, 徐貴云
【申請人】廣州維伯鑫生物科技有限公司
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月5日