精神分裂癥生物標(biāo)記物、篩選方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及精神分裂癥生物標(biāo)記物、篩選方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 精神分裂癥（schizophrenia, SZ)是最為嚴(yán)重的精神障礙之一，以幻覺(jué)、妄想、精 神運(yùn)動(dòng)性興奮等陽(yáng)性癥狀和（或）以情感遲鈍、情感淡漠、社交退縮、意志減退等陰性癥狀 為主要臨床特征，其對(duì)患者的認(rèn)知、情感、行為和社會(huì)功能造成嚴(yán)重?fù)p害。
[0003] 目前，雖對(duì)SZ的病因已有一定的認(rèn)識(shí)，如研宄者依據(jù)神經(jīng)影像學(xué)、基因組學(xué)、蛋白 組學(xué)、免疫組化等技術(shù)對(duì)SZ病因?qū)W研宄的結(jié)果涉及遺傳因素、社會(huì)心理因素、神經(jīng)生化病 理學(xué)說(shuō)及大腦病理和腦結(jié)構(gòu)變化學(xué)說(shuō)等。但對(duì)其病理過(guò)程尚缺乏充分的了解，這阻礙了對(duì) SZ診斷、治療、康復(fù)技術(shù)的進(jìn)步。大量研宄顯示，遺傳因素在SZ發(fā)生、預(yù)后、療效、復(fù)發(fā)中起 主要作用，從SZ的家族聚集性，患者同胞再患的危險(xiǎn)度以及同卵、異卵雙生共患的差異推 斷，遺傳因素占 SZ發(fā)病因素的65%~85%。因此，對(duì)SZ遺傳機(jī)制及其調(diào)控過(guò)程的了解，對(duì) 揭示其病理過(guò)程具有重要意義，對(duì)SZ的診斷和治療也具有較好的前景。
[0004] 已有研宄表明，精神分裂癥病人若能早期明確診斷并及時(shí)得到有效治療，可以顯 著改善患者的心理、生理、社會(huì)功能以及工作效率，并大大減少治療費(fèi)用。然而，目前對(duì)精神 分裂癥的診斷仍是依靠其臨床癥狀的主觀評(píng)估，缺乏有效的客觀診斷"金標(biāo)準(zhǔn)"，因而在臨 床上誤診、誤治時(shí)有發(fā)生。另一方面，由于事先未知患者對(duì)哪種藥物敏感，臨床上不得不用 "試錯(cuò)法"給藥，這不僅影響患者的治療效果，而且降低其服藥依從性，并造成巨大的醫(yī)療資 源浪費(fèi)。因此，有必要研發(fā)一種具有敏感性和特異性的生物標(biāo)志物，來(lái)提高精神分裂癥的診 斷科學(xué)性，并對(duì)其亞型加以區(qū)分，以便于有針對(duì)性地進(jìn)行藥物干預(yù)和開展臨床科學(xué)研宄。
[0005] miRNA是一種小分子的非編碼RNA，長(zhǎng)度為大約為22個(gè)堿基。miRNA的生成包括兩 步剪切：首先細(xì)胞核內(nèi)的miRNA基因轉(zhuǎn)錄成pri-miRNA，由細(xì)胞核內(nèi)的酶DroshaRNase將其 剪切成miRNA前體pre-miRNA。核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將pre-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，然后在細(xì) 胞質(zhì)中的另一種酶Dicer把miRNA前體剪切成雙鏈miRNA，通過(guò)部分或完全地與靶mRNA的 3'非翻譯區(qū)（3'UTR)互補(bǔ)配對(duì)，阻止其翻譯或使其降解，從而起到基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的作用。 約有50%的蛋白質(zhì)編碼基因受到miRNA的精確調(diào)控，多個(gè)miRNA分子可以共同調(diào)節(jié)一個(gè)基 因的表達(dá)，一個(gè)miRNA分子亦可調(diào)控?cái)?shù)百、上千個(gè)基因的表達(dá)。越來(lái)越多的研宄證明，在大 腦的發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元成熟及突觸形成過(guò)程中，miRNA起關(guān)鍵的調(diào)控作用。進(jìn)一步的 研宄表明，精神分裂癥的發(fā)生、發(fā)展中，miRNA亦起重要作用，并與抗精神病藥物的療效有相 關(guān)性。因此，某些MicroRNA可成為精神分裂癥診斷和預(yù)測(cè)抗精神分裂癥藥物治療效果的生 物標(biāo)記物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供精神分裂癥生物標(biāo)記物、篩選方法及試劑盒。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供了精神分裂癥診斷生物標(biāo)記物，所述標(biāo)記物包括 miRNA-1273d、miRNA-1303、miRNA-3064-5p、miRNA-3131、miRNA-3687、miRNA-4428、 miRNA-4725-3p 和 miRNA-5096。
[0008] 在本發(fā)明的第二方面，提供了上述精神分裂癥診斷生物標(biāo)記物的篩選方法，包括 以下步驟：分別選取等量的精神分裂癥患者和健康對(duì)照組數(shù)名，取血樣，從中提取總RNA， 提取得到的總RNA經(jīng)過(guò)Ploly A加尾，再進(jìn)一步用生物素標(biāo)記，標(biāo)記好的RNA與RNA芯片雜 交并通過(guò)RNA芯片篩查出差異性表達(dá)的miRNA ;選取若干例精神分裂癥患者，設(shè)為病例組； 選取若干例健康對(duì)照者，設(shè)為對(duì)照組；分別采集血樣，提取出外周血單核細(xì)胞中的總RNA 后進(jìn)行miRNA的反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，對(duì)通過(guò) RNA芯片篩查得到的差異性表達(dá)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，得到在病例組和對(duì)照組間呈顯著差異的 miRNA種類。
[0009] 在本發(fā)明的第三方面，提供了 一種精神分裂癥診斷試劑盒，其能夠測(cè)定血液 中 miRNA-1273d、miRNA-1303、miRNA-3064-5p、miRNA-3131、miRNA-3687、miRNA-4428、 miRNA-4725-3p 和 miRNA-5096 的含量。
[0010] 優(yōu)選的，所述精神分裂癥診斷試劑盒含有miRNA-1273d、miRNA-1303、 miRNA-3064-5p、miRNA-3131、miRNA-3687、miRNA-4428、miRNA-4725-3p 和 miRNA-5096 的引 物探針，所述探針序列如 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
[0011] 所述試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用試劑，如Taq酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs， MgCljP DEPC水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br>[0012] 在本發(fā)明的第四方面，還提供了序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示的探針的用 途，其用于制備精神分裂癥診斷試劑盒。
[0013] 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種預(yù)測(cè)精神分裂癥療效的生物標(biāo)記物，所述標(biāo)記 物包括 miRNA-21-3p 和 miRNA-3916。
[0014] 在本發(fā)明的第六方面，提供了上述預(yù)測(cè)抗精神分裂癥藥物療效的生物標(biāo)記物的篩 選方法，包括以下步驟：選取若干例精神分裂癥患者進(jìn)行臨床藥物干預(yù)隨訪觀察，對(duì)選取的 患者分別施以臨床常用的抗精神分裂癥藥物，在用藥前后分別采集血樣，提取出外周血單 核細(xì)胞中的總RNA后進(jìn)行miRNA的反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 進(jìn)行分析，得到用藥前后表達(dá)水平有顯著性差異的miRNA。
[0015] 在本發(fā)明的第七方面，提供了一種預(yù)測(cè)抗精神分裂癥藥物療效的生物標(biāo)記物檢測(cè) 試劑盒，其能夠測(cè)定血液中miRNA-21-3p和miRNA-3916的含量。
[0016] 優(yōu)選的，所述預(yù)測(cè)抗精神分裂癥藥物療效的生物標(biāo)記物檢測(cè)試劑盒含有 miRNA-21-3p和miRNA-3916的引物探針，所述探針序列如SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所 不O
[0017] 所述試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用試劑，如Taq酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs， MgCljP DEPC水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br>[0018] 在本發(fā)明的第八方面，還提供了序列如SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示的探針 的用途，其用于制備預(yù)測(cè)抗精神分裂癥藥物療效的試劑盒。
[0019] 在本發(fā)明的第九方面，提供了鑒別精神分裂癥與廣泛性焦慮癥、抑郁癥、精神發(fā)育 遲滯的試劑盒，所述試劑盒含有miRNA-26b的引物探針，所述探針序列如SEQ ID NO. 11所 不O
[0020] 在本發(fā)明的第十方面，還提供了序列如SEQ ID NO. 11所示的探針的用途，其用于 制備鑒別精神分裂癥與廣泛性焦慮癥、抑郁癥、精神發(fā)育遲滯的試劑盒。
[0021] 所述試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用試劑，如Taq酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs， MgCljP DEPC水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br>[0022] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0023] 1、精神分裂癥的診斷將不依靠主觀經(jīng)驗(yàn)判斷，而是可以通過(guò)microRNA表達(dá)水平 這種客觀指標(biāo)檢查，進(jìn)行確診，提高診斷準(zhǔn)確率，簡(jiǎn)化診斷過(guò)程；
[0024] 2、有望通過(guò)miRNA模擬物和拮抗物（修飾寡核苷酸）改變特定miRNA表達(dá)水平能 夠使異常的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路正?；?，進(jìn)而治療精神分裂癥；
[0025] 3、有望通過(guò)檢測(cè)特定miRNA表達(dá)水平對(duì)抗精神分裂癥藥物的療效進(jìn)行預(yù)測(cè)；4、有 望通過(guò)檢測(cè)特定miRNA表達(dá)水平對(duì)精神分裂癥患者轉(zhuǎn)歸及