Mait樣細(xì)胞及其制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及由MAIT細(xì)胞制作人工多能干細(xì)胞的方法、以及MAIT細(xì)胞來源的人工 多能干細(xì)胞。另外，本發(fā)明涉及由人工多能干細(xì)胞制作MAIT樣細(xì)胞的方法、以及由此得到 的MAIT樣細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] MAIT 細(xì)胞（Mucosal associated invariant T cells，粘膜相關(guān)的恒定 T 細(xì)胞） 可產(chǎn)生各種細(xì)胞因子以控制各種免疫反應(yīng)，是作為承擔(dān)自然免疫和獲得免疫的"橋梁作用" 的細(xì)胞而已知的自然免疫T淋巴細(xì)胞的一種。MAIT細(xì)胞在人中豐富地存在，例如在肝臟中 的T細(xì)胞中占20-50%，占腸道粘膜淋巴細(xì)胞固有層（lamina propria lymphocytes :LPL) 或外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells :PBMC)的 1-10%，另一方面， 在小鼠中為稀有的細(xì)胞（Dusseaux et al.，2011 ;Le Bourhis et al.，2011)。
[0003] 作為MAIT細(xì)胞的另一特征，可以舉出T細(xì)胞受體（T cell rec印tor :TCR)的單 一性。T細(xì)胞特異性表達(dá)的TCR將與主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex :MHC)分子結(jié)合的肽片段作為抗原進(jìn)行識別。TCR由在細(xì)胞表面表達(dá)的兩個多 肽鏈、a鏈和|3鏈構(gòu)成，兩條鏈均在N末端的抗原結(jié)合區(qū)針對被稱為可變（variable: V)區(qū)的每個TCR分子具有氨基酸序列不同的部位，該V區(qū)的多樣性決定了免疫反應(yīng)中的 T細(xì)胞的抗原特異性。TCR的V區(qū)與免疫球蛋白同樣地由包括多個亞型的V(Variable)、 D (Diversity)、J (Joining)基因片段構(gòu)成，a鏈中V和J的各1個片段通過DNA重組而結(jié) 合，0鏈中V、D、J的各1個片段通過DNA重組而結(jié)合，形成了編碼該區(qū)域的基因。
[0004] 另一方面，在T細(xì)胞中，作為其TCR未呈多樣性的單一的細(xì)胞，已知自然殺傷T細(xì) 胞（Natural killer T cells :NKT細(xì)胞）和MAIT細(xì)胞這兩種。在人的情況下，MAIT細(xì)胞 的TCRa鏈僅為Va7. 2_Ja33的組合，在NKT細(xì)胞的情況下，其組合為Va24_Ja 18(Le Bourhis et al.，2011)。另外，在小鼠的情況下，MAIT細(xì)胞的TCRa鏈僅為Val9_Ja33 的組合，在NKT細(xì)胞的情況下，其組合為V a 14-J a 18。對兩細(xì)胞的TCR來說，能夠結(jié)合的 抗原呈遞分子（約束性）也不同，MAIT細(xì)胞的TCR識別?結(jié)合與一般的T細(xì)胞中的抗原 呈遞分子MHC類似的、無多樣性的MR1 (MHC-相關(guān)分子-1)，在NKT的情況下，將MHC類似的 (Did (cluster of differentiation (分化群）-Id)作為抗原呈遞分子。MAIT細(xì)胞特異性 的TCR和MR1以進(jìn)化良好的方式被保存，暗示了在廣泛物種中的功能重要性（Le Bourhis et al. , 2011) 〇
[0005] MAIT細(xì)胞在表達(dá)上述invariant TCRa鏈的同時，作為特異性的表面抗原標(biāo)記 分子而表達(dá)作為C型凝集素的⑶161(別名，natural killer cell surface protein(自 然殺傷細(xì)胞表面蛋白）：NKRP1)和白細(xì)胞介素（IL)-18受體a鏈（IL_18Ra) (Cosmi et al.，2008 ;Le Bourhis et al.，2010)。即，MAIT細(xì)胞可以與CD3等一般性的T細(xì)胞標(biāo)記物 一同作為表達(dá)MAIT特異性的invariant TCRa鏈、⑶161、IL_18Ra的細(xì)胞來進(jìn)行規(guī)定。另 外，MAIT細(xì)胞呈現(xiàn)出⑶45RA\⑶45R0+、⑶95high、⑶62L 1?等效應(yīng)/記憶型T細(xì)胞的性狀，同 時由于趨化因子受體的表達(dá)為CCR9int、CCR7' CCR5high、CXCR6high、CCR6high，因而暗示了向腸 道或肝臟等的歸位指向性O(shè)usseaux et al.，2011)。
[0006] 另外，據(jù)報道：MAIT細(xì)胞在產(chǎn)生干擾素（IFN)y、IL-17、IL-2等細(xì)胞因子、或顆 粒酶B的同時，幾乎不顯示出增殖性，表達(dá)多藥耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCB1而顯示出多藥耐藥 性（Dusseaux et al.，2011)。通過這些特性，暗示了 MAIT細(xì)胞對于腸內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生的異物 具有抵抗性，和/或參與生物體內(nèi)的感染防御系統(tǒng)。事實(shí)上，據(jù)報道MAIT細(xì)胞是與感染 結(jié)核菌等細(xì)菌或真菌的細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的特殊的T細(xì)胞，同時在結(jié)核等的細(xì)菌感染患者中 發(fā)現(xiàn)了 MAIT細(xì)胞的減少，并且由使用了小鼠的模型實(shí)驗(yàn)表明，MAIT細(xì)胞防御膿腫分枝桿 菌（Mycobacterium abscessus)、大腸桿菌（Escherichia coli)的感染（Le Bourhis et al.，2010 ;Gold et al.，2010 ;Dusseaux et al.，2011)。由以上的結(jié)果推測了 MAIT細(xì)胞作 為針對細(xì)菌感染的自然免疫淋巴細(xì)胞的功能。
[0007] 此外，MAIT細(xì)胞暗示了與以多發(fā)性硬化癥為代表的自身免疫性疾病、炎癥性疾病、 癌的發(fā)病和發(fā)展的相關(guān)性。CD8+/CD161 highT細(xì)胞集聚于肝臟或關(guān)節(jié)等的炎癥部位，是被認(rèn) 為是多發(fā)性硬化癥的發(fā)病原因的T細(xì)胞群，表明，在人PBMC中CD8+/CD161 highT細(xì)胞的90% 為作為MAIT細(xì)胞特異性的TCR a鏈的V a 7. 2+(Walker et al.，2011)。進(jìn)而，據(jù)報道，在 多發(fā)性硬化癥患者中其病變部集聚有更多的MAIT細(xì)胞（Illes et al.，2004;Miyazaki et al.，2011)。還有報道稱，MAIT細(xì)胞的集聚為腎癌或腦腫瘤（Peterfalvi et al.，2008)、慢 性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)?。↖lles et al.，2004)。另外，關(guān)于以潰瘍性結(jié)腸炎或克隆 病為代表的炎癥性腸疾病，據(jù)報道，引入的MAIT細(xì)胞對藥物引起的炎性組織損傷具有保護(hù) 作用（Xiao Ruijing et al.，2012)。
[0008] 這樣，MAIT細(xì)胞被暗示參與各種疾病或病狀，但現(xiàn)狀是，關(guān)于免疫控制機(jī)制、特別 是自然免疫中的作用及其詳細(xì)的機(jī)理、有助于其的因子及分子、進(jìn)而在病狀發(fā)病和發(fā)展中 的意義等，還未進(jìn)行充分的研宄和分析。作為其重要的原因之一，可以舉出能夠供體外（in vitro)及體內(nèi)（in vivo)試驗(yàn)的細(xì)胞來源的問題。
[0009] 如上所述，在作為實(shí)驗(yàn)用動物而頻繁使用的小鼠中，MAIT細(xì)胞是非常稀有的細(xì)胞 群，難以使用該動物進(jìn)行功能分析。另一方面，與小鼠相比，MAIT細(xì)胞在人中豐富地存在，但 是由外周血等人生物體試樣大量制備MAIT細(xì)胞存在界限。另外，在這種方法中，所得到的 MAIT細(xì)胞的數(shù)量及性質(zhì)發(fā)生大幅變動的可能性也高，使用該細(xì)胞的試驗(yàn)的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性 存在困難。進(jìn)而，MAIT細(xì)胞通常為幾乎不具有細(xì)胞增殖能力的狀態(tài)，而且誘導(dǎo)其增殖的因 子及刺激未被確定，因此在in vitro條件下無法增殖（Dusseaux et al.，2011)。所以，作 為為了廣泛進(jìn)行使用MAIT細(xì)胞的研宄的一個解決方案，例如考慮了利用與MAIT細(xì)胞功能 類似的模型細(xì)胞，但現(xiàn)狀是幾乎不知道具有這種特性的細(xì)胞株。
[0010] 另外，作為MAIT細(xì)胞的未來的活用法之一，考慮在罹患各種感染癥或自身免疫性 疾病、癌的患者中引入MAIT細(xì)胞或經(jīng)人工修飾的MAIT細(xì)胞來進(jìn)行治療，即作為所謂細(xì)胞移 植療法中使用的細(xì)胞源進(jìn)行利用。但是，為了實(shí)現(xiàn)該治療法，依然需要確立具有穩(wěn)定品質(zhì) 的、可制備大量的MAIT細(xì)胞的方法。
[0011] 近年來，作為在生物體外制備各種細(xì)胞的方法，廣泛地進(jìn)行了下述嘗試：將多能干 細(xì)胞用作原始細(xì)胞，分化誘導(dǎo)該細(xì)胞而制作出目標(biāo)細(xì)胞。多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells)是指如下定義的細(xì)胞：通過試管內(nèi)培養(yǎng)而保持未分化狀態(tài)，在此狀態(tài)下能夠幾乎 永久或長期地進(jìn)行細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)出正常的核（染色體）型，在適當(dāng)條件下具有分化成所 有三胚層（外胚層、中胚層和內(nèi)胚層）的家譜的細(xì)胞的能力。作為多能干細(xì)胞，可以舉出 由早期胚胎分離的胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells :ES細(xì)胞）或由胎兒期的原始生 殖細(xì)胞分離的胚胎生殖細(xì)胞（embryonic germ cells)、由剛出生后的精巢分離的生殖干 細(xì)胞（germline stem cells)、進(jìn)而通過特殊的基因操作由成纖維細(xì)胞等體細(xì)胞制作的人 工（誘導(dǎo)）多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells;下文中稱為iPS細(xì)胞）等 (Lengner, 2010 ；Pfannkuche et al, 2010 ;0kita and Yamanaka, 2011) 〇
[0012] 關(guān)于由多能干細(xì)胞制作血細(xì)胞系細(xì)胞或淋巴細(xì)胞系細(xì)胞的事例有許多報道，選 擇性地制作出T細(xì)胞的方法也是公知的。即，在以未分化狀態(tài)維持ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞等 多能干細(xì)胞后，接種于具有造血細(xì)胞維持能力的基質(zhì)細(xì)胞（例如0P9細(xì)胞）上，誘導(dǎo)向 造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的分化，對其進(jìn)行回收后，接著在強(qiáng)制表達(dá)作為Notch配體的 delta-like-1 (DLL1)的0P9細(xì)胞（0P9/DLL1)上可以制作出具有作為T細(xì)胞的特性的細(xì)胞 (Schmitt et al.，2004 ;Timmermans F et al.，2011)。另外還報道了下述方法：對于由小 鼠NKT細(xì)胞制作的iPS細(xì)胞，通過使用該0P9共培養(yǎng)體系，制作具有作為NKT細(xì)胞的特性的 細(xì)胞（W02008/038579 ;Wakao H et al.，2008 ;W02010/027094 ;Watarai et al.，2010) 〇
[0013] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0014] 專利文獻(xiàn)
[0015] 專利文獻(xiàn) 1 :TO2008/038579
[0016] 專利文獻(xiàn) 2 :TO2010/027094
[0017] 非專利文獻(xiàn)
[0018] 非專利文獻(xiàn) 1 :Dusseaux et al.，Blood 117, 1250-1259(2011)
[0019] 非專利文獻(xiàn) 2 :Le Bourhis et al.，Trends in Immunol. 32, 212-218 (2011)
[0020] 非專利文獻(xiàn) 3 :Cosmi et al.，J. Exp. Med. 205, 1903-1916,（2008)
[0021] 非專利文獻(xiàn) 4 :Le Bourhis et al.，Nat. Immunol. 11，701-708(2010)
[0022] 非專利文獻(xiàn) 5 :Gold et al.，PLoS Biol. 8, e100 0407 (2010)
[0023] 非專利文獻(xiàn) 6 :Walker et al.，Blood 119,422-433(2011)
[0024] 非專利文獻(xiàn) 7 :Illes et al.，Int. Immunol. 16, 223-230(2004)
[0025] 非專利文獻(xiàn) 8 :Miyazaki et al.，Int. Immunol. 23, 529-535 (2011)
[0026] 非專利文獻(xiàn) 9 :Peterfalvi et al.，Int. Immunol. 20, 1517-1525 (2008)
[0027] 非專利文獻(xiàn) 10 :Xiao Rui j ing et al.，Hepatogastroenterolo gyll5, 762-767(2012)
[0028] 非專利文獻(xiàn) 11 :Lengner CJ, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1192,38-44(2010)
[0029] 非專利文獻(xiàn) 12 :Pfannkuche K et al. , Cell Physiol Biochem. 26, 105-24(2010)
[0030] 非專利文獻(xiàn) 13 :0kita and Yamanaka, Philos. Trans. R Soc. Lond. B Biol. Sci. 366, 2198-2207(2011)
[0031] 非專利文獻(xiàn) 14 :Schmitt et al. , Nat. Immunol. 5, 410-417 (2004)
[0032] 非專利文獻(xiàn) 15 :Timmermans et al. , J. Immunol. 182, 6879-6888 (2011)
[0033] 非專利文獻(xiàn) 16 :Wakao et al. , FASEB J. 22, 2223-2231 (2008)
[0034] 非專利文獻(xiàn) 17 :Watarai et al. , J. Clin. Invest. 120, 2610-8 (2010)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0035] 發(fā)明要解決的問題
[0036] 在T細(xì)胞中，作為其TCR未呈多樣性的單一（invariant，恒定）的細(xì)胞，已知NKT 細(xì)胞和MAIT細(xì)胞這兩種。NKT細(xì)胞在對細(xì)菌或癌進(jìn)行個體防御方面起到重要的作用，同時 在自我免疫性疾