一種盧娜林瑞鏈霉菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是指一種盧娜林瑞鏈霉菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 鏈霉菌屬（Str印tomyces)，其基內(nèi)菌絲多分枝，一般橫隔稀疏，很少斷裂，常產(chǎn)生 各種水溶性或脂溶性的色素；氣生菌絲比基內(nèi)菌絲稍粗，為外鞘所包，氣生菌絲部分分化成 直形、柔曲、鉤環(huán)狀至松敞或緊密螺旋形的孢子絲，時常含50個左右的孢子，短者含5~10 個孢子；孢子為節(jié)孢子，由菌絲斷裂而成，有的脫去外鞘，有的攜帶外鞘或殘余，外鞘決定 孢子的表面結構；DNA中的G+C克分子含量為69~76 %。本屬菌種數(shù)最多，分類鑒定比較 困難，一般認為孢子絲的形狀、孢子的表面結構、孢子的顏色和在有機培養(yǎng)基內(nèi)是否產(chǎn)生類 黑色素是最主要的分類指征。它們在土壤中分布極廣，大多在人工培養(yǎng)基上生長茂盛，少數(shù) 是植物致病菌。
[0003] 香蕉是為芭蕉科芭蕉屬多年生草本植物，是熱帶、亞熱帶主要水果之一。由于香蕉 栽培區(qū)域廣泛，導致多種病蟲害的爆發(fā)，如香蕉枯萎病、香蕉炭疽病、葉斑病等等，其中尤其 以香蕉枯萎病危害最為嚴重，一旦大規(guī)模爆發(fā)，會給當?shù)叵憬对耘鄮須缧缘拇驌?。香?枯萎病是一種由真菌侵染引起的土傳病害。此病原菌為尖孢鐮刀菌，是一種土壤習居菌，土 壤消毒，降低土壤中病原菌的數(shù)量是防治香蕉枯萎的重要手段之一。而本研宄通過對香蕉 枯萎病發(fā)病區(qū)的蕉園土壤中微生物進行篩選，以期得到抑制香蕉枯萎病菌的菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提出一種鏈霉菌及其應用，對多種病原菌均有抑制作用，抑菌效果顯著。
[0005] 本發(fā)明的第一個方面提供一種盧娜林瑞鏈霉菌，命名為盧娜林瑞鏈霉菌 (Streptomyces lunalinharesii)B_03,于2015年3月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，地址為湖北省武漢市武漢大學內(nèi)，保藏編號為CCTCC NO !M2015148。
[0006] 所述盧娜林瑞鏈霉菌B-03的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 本發(fā)明的第二個方面是提供本發(fā)明第一個方面所述的盧娜林瑞鏈霉菌B-03在制 備防治香蕉枯萎病菌制劑中的應用。
[0008] 本發(fā)明的第三個方面是提供本發(fā)明第一個方面所述的盧娜林瑞鏈霉菌B-03在制 備抑制香蕉炭疽菌、香蕉長形葉斑病、香蕉大灰斑病、貢蕉眼斑病、香蕉葉緣枯萎病、荔枝炭 疽菌的制劑的應用。
[0009] 本發(fā)明的第四個方面是提供一種盧娜林瑞鏈霉菌菌株發(fā)酵液，將本發(fā)明第一個方 面所述的盧娜林瑞鏈霉菌B-03接種于大豆粉發(fā)酵培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)3~5d后得到發(fā)酵種子 液，將所述發(fā)酵種子液接種于豆餅培養(yǎng)基中，28°C~30°C，ISOrpm震蕩培養(yǎng)7~10d，得到所 述的菌株發(fā)酵液。
[0010] 進一步，所述的大豆粉培養(yǎng)及的組成，按重量份記為：大豆粉5~10份、NaCll~5 份、CaC03 1~3份、蛋白胨2~5份、葡萄糖5~10份；所述大豆粉培養(yǎng)基pH值為7. 0~ 7. 5 ;所述的豆餅發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，按重量份記為：紅糖180~200份，豆餅50~70份，水 800 ~1200 份。
[0011] 本發(fā)明的第五個方面是提供一種盧娜林瑞鏈霉菌菌株發(fā)酵液在制備抑制尖孢鐮 刀菌1號小種、尖孢鐮刀菌4號小種和膠孢炭疽菌制劑的應用。
[0012] 本發(fā)明的第六個方面是提供一種盧娜林瑞鏈霉菌菌株發(fā)酵液在制備抑制香蕉枯 萎病制劑的應用
[0013] 進一步，將本發(fā)明第六個方面所述的菌株發(fā)酵液稀釋后，直接施用于大田作物。
[0014] 進一步，所述的菌株發(fā)酵液稀釋50~100倍后灌根或者地面噴施。
[0015] 本發(fā)明所述的盧娜林瑞鏈霉菌菌株，經(jīng)多項鑒定，確定為盧娜林瑞鏈霉菌 (Streptomyces lunalinharesii)B_03,并于2015年3月23日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)進行了菌種保藏，并證明存活，保藏地址為中國湖北省武漢市武漢大學內(nèi)，保藏編 號為 CCTCC NO :M2015148。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] 本發(fā)明所述的盧娜林瑞鏈霉菌B-03,對香蕉枯萎病菌具有較好的抑制作用，制備 的菌株發(fā)酵液施用在盆栽香蕉苗上，對香蕉枯萎病具有顯著的防控效果。此外，本發(fā)明所述 的鏈盧娜林瑞鏈霉菌同時對香蕉炭疽菌、香蕉長形葉斑病、香蕉大灰斑病、貢蕉眼斑病、香 蕉葉緣枯萎病以及荔枝炭疽菌等病原菌也具有較好的抑制作用，具有廣泛的抗菌效果，對 于植物病害的綜合防控，尤其是香蕉栽培過程中多發(fā)、高發(fā)病害的綜合防控，具有重大的意 義。
【附圖說明】
[0018] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0019] 圖1為盧娜林瑞鏈霉菌B-03在不同培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)圖片；
[0020] 圖中，ISPl為高氏一號培養(yǎng)基；ISP2為酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基；燕麥片ISP3為 瓊脂培養(yǎng)基；ISP4為無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基；ISP5為葡萄糖-天冬素瓊脂培養(yǎng)基；ISP6為 蛋白胨-酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基；ISP7酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基。
[0021] 圖2為盧娜林瑞鏈霉菌B-03對貢蕉眼斑病菌抑制活性檢測圖片；
[0022] 圖3為盧娜林瑞鏈霉菌B-03對荔枝炭疽病菌抑制活性檢測圖片；
[0023] 圖4為盧娜林瑞鏈霉菌B-03對香蕉大灰斑病菌抑制活性檢測圖片；
[0024] 圖5為盧娜林瑞鏈霉菌B-03對香蕉枯萎病菌抑制活性檢測圖片；
[0025] 圖6為盧娜林瑞鏈霉菌B-03對香蕉葉緣枯萎病菌抑制活性檢測圖片；
[0026] 圖7為盧娜林瑞鏈霉菌B-03對香蕉長形葉斑病菌抑制活性檢測圖片；
[0027] 圖8為盧娜林瑞鏈霉菌B-03對香蕉炭疽菌抑制活性檢測圖片；
[0028] 在圖2~圖8中，a為盧娜林瑞鏈霉菌B-03菌株，b為貢蕉眼斑病病菌，c為荔枝 炭疽病菌，d為香蕉大灰斑病菌，e為香蕉枯萎病病菌，f為香蕉葉緣枯萎病菌，g為香蕉長 形葉斑病菌，h為香蕉炭疽菌。
[0029] 圖9為采用生物自顯影薄層色譜法檢測盧娜林瑞鏈霉菌B-03發(fā)酵液原液對不同 病原菌的抑制作用圖片。
[0030] 圖9中，A為膠孢炭疽菌，B為尖孢鐮刀菌1號小種，C為尖孢鐮刀菌4號小種。
【具體實施方式】
[0031] 下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0032] 一、菌株的篩選
[0033] 分別于海南省南寶鎮(zhèn)新營農(nóng)場枯萎病發(fā)病區(qū)的蕉園取土壤樣品。取樣方法為每個 田塊采用五點隨機取樣混合為一個樣品，采集香蕉植株根圍土壤（IOcm~30cm 土層）。從 田間采集的新鮮樣品放入塑料樣品采集袋中，并置于冰盒中，帶回實驗室置于4°C冰箱中保 存?zhèn)溆谩?br>[0034] 采用梯度稀釋法將上述土壤樣品制成KT2~KT4濃度梯度系列懸浮液，放線菌的 分離，采用高氏一號培養(yǎng)基（使用前要加入3%重鉻酸鉀抑制細菌、真菌的生長）；細菌的分 離，采用LB培養(yǎng)基和KT 4~KT6稀釋度。用移液器分別吸取上述不同稀釋度的溶液0. lmL， 滴加于培養(yǎng)基平板上，用L型玻棒涂布均勻，稍晾干，培養(yǎng)皿倒置，于25~28°C溫箱中培養(yǎng) 2~5d，根據(jù)平板上長出的菌落的顏色、形態(tài)、大小的細菌、和放線菌的單菌落挑出到新的 培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)，對純化后的菌株分別編號，保存并記錄不同樣品分離到的菌株數(shù) 目。
[0035] 采用平板對峙培養(yǎng)法，檢測上述分離到的各種細菌、放線菌菌株（以下稱"待測菌 株"）對尖孢鐮刀菌4號生理小種（以下稱"靶標菌株"）的抑菌活性，用打孔器（直徑6mm) 在提前3d活化并培養(yǎng)好靶標菌株菌落邊緣切取菌絲塊，并轉接在另一個PDA平板中央，再 將活化后的待測菌株接種在距靶標菌株菌絲塊2~3cm處，每平板接種四個待測菌株，以不 接任何待測菌株的靶標菌株為對照，每個菌株三次重復。25~28°C恒溫培養(yǎng)一段時間后， 測量待測菌株與靶標菌株之間的抑菌帶寬度，篩選出對尖孢鐮刀菌4號生理小種具有拮抗 作用的菌株B-03。
[0036] LB培養(yǎng)基組成：胰蛋白陳10. 0g、酵母粉5. 0g、NaCl 10. 0g、瓊脂17~20.0 gdK 1000.0 mL，用lmol/L NaOH調(diào)pH值至L 5。不加瓊脂的為LB培養(yǎng)液。
[0037] PDA培養(yǎng)基組成：馬鈴薯200. 0g、葡萄糖20. 0g、瓊脂粉17~20. 0g、水1000.0 mL。
[0038] 二、菌株的鑒定
[0039] L菌株B-03的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0040] 2.菌株B-03的16S rDNA基因測序BLAST結果如下表1所示。
[0041] 表1菌株B-03的16S rDNA基因測序BLAST結果
[0042]
[0043]
[0044]
[0047] 4.菌株B-03的生長情況和形態(tài)
[0048] 在不同的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)分離得到的鏈霉菌菌株，比較其培養(yǎng)性狀，如表2所示， 菌株在不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)性狀如圖1所示，菌種顯微鏡（1000X)下照片如圖2-7所示。培 養(yǎng)基按照以下配方配制。
[0049] 高氏一號培養(yǎng)基（ISPl):可溶性淀粉 20. 0g、NaCl 0· 5g、KNO3 I. 0g、K2HPO4 · 3H20 0.5g、MgS0 4·7Η20 0.5g、FeS0 4·7Η20 O.Olg、瓊脂 15-20g、H20 1000mL。大豆粉發(fā)酵培養(yǎng) 基：大豆粉 10. 〇g、NaCl 2. 5g、CaC03 2. 0g、蛋白胨 3. 0g、葡萄糖 10. 0g，pH 7· 2 ~7· 4。
[0050] 酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基（ISP2):酵母膏10g、麥芽浸粉10g、葡萄糖4g、pH 7· 3。 燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（ISP3):麥片20g，微量鹽溶液lmL。
[0051] 無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基（ISP4):淀粉 10g、K2HP04lg、MgS0