一種厭氧培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢驗微生物培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種厭氧培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物培養(yǎng)是一種用人工方法使微生物生長繁殖的技術(shù)，專性厭氧菌必須在 無氧的環(huán)境中才能生長，厭氧培養(yǎng)基是通過物理、化學(xué)等方法營造培養(yǎng)基的無氧環(huán)境 以提供專性厭氧菌生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)和無氧環(huán)境而設(shè)計的培養(yǎng)基。壞死梭桿菌 (Fusobacterium necrophorum, Fn)為梭桿菌屬、革蘭氏染色陰性、嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌。致病 性Fn菌株產(chǎn)生多種獨立因子，如白細(xì)胞毒素（leukotoxin, Lkt)、溶血素（hemolysin)、血凝 素（hemagglutinin)和內(nèi)毒素（endotoxin)等，能引發(fā)多重哺乳動物(包括人類）和禽類的 壞死桿菌?。╪ecrobacillosis)。壞死梭桿菌是各種化膿壞死性感染疾病的主要和次要病 原，廣泛存在于動物和人的口腔、呼吸道和胃腸道等天然腔道內(nèi)，以及化膿性壞死病灶和梗 死的組織器官內(nèi)，屬條件致病菌。Fn -般通過有創(chuàng)傷的皮膚或粘膜侵入機體，與其他細(xì)菌 如大腸桿菌或金黃色葡萄球菌、化膿性棒狀桿菌等化膿類細(xì)菌聯(lián)合感染宿主引起壞死桿菌 病，該病在動物中常見且危害嚴(yán)重，人類主要引起急性咽炎綜合癥（Lemierre' s)、手部皮 膚、口腔和肺部膿腫。這些疾病典型的癥狀是存在膿腫或壞死性病灶，并有惡臭氣味。此 外，有的還伴隨菌血癥的發(fā)生對宿主生命安全造成嚴(yán)重威脅，臨床癥狀與鏈球菌性咽炎、細(xì) 菌性肺炎癥狀類似，易誤診。因此作為確診唯一依據(jù)的臨床細(xì)菌檢查的正確與快速鑒定極 為重要。
[0003] 目前，壞死梭桿菌檢驗手段主要是采用以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測方法，該方法需要對樣本進(jìn)行DNA提取和PCR引 物設(shè)計，且需要配備PCR相關(guān)儀器設(shè)備，成本昂貴，操作復(fù)雜，基層實驗室難以實現(xiàn)。實驗室 常用CDC厭氧菌瓊脂培養(yǎng)壞死梭桿菌，由于基層醫(yī)院檢驗科大多缺乏無氧檢驗設(shè)備，因此 大多用"厭氧缸培養(yǎng)法"，所謂的厭氧缸是普通的干燥缸，接種好標(biāo)本的平板或液體培養(yǎng)基 試管放入干燥缸內(nèi)培養(yǎng)，通過物理化學(xué)的方法耗盡缸內(nèi)氧氣，造成厭氧環(huán)境。厭氧缸法的氧 氣耗盡需要時間，而壞死梭桿菌為專性厭氧桿菌，因此該種培養(yǎng)技術(shù)存在以下缺陷：①厭氧 缸內(nèi)CDC厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基上的壞死梭桿菌生長緩慢，陽性檢出率低，一周左右方可較準(zhǔn) 確的作出鑒定；②由于非絕對無氧條件，因此咽喉分泌物標(biāo)本內(nèi)需氧菌和兼性厭氧菌具有 生存條件，培養(yǎng)基分離能力差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合于壞死梭桿菌生長 的厭氧培養(yǎng)基。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案是：一種厭氧培養(yǎng)基，其特征在于，配制 1000ml培養(yǎng)基的配方中含有： 胰酪蛋白胨5.0~10.0 g; 葡萄糖5. O~10.0 g ; 酵母粉5. 0~10.0 g ; 氯化鈉 5. Og ; 瓊脂 15. 0 ~20.0 g ; 牛膽鹽〇· 5~1.0 g ; 乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽2~3g ; γ-氨基丁酸〇. 1~〇. 5g ; 結(jié)頁氨酸〇· 1~〇· 5g ; L-高精氨酸0. 01~0. 05g ; 無菌熱變形小牛血清50~100mL ; 蒸餾水加至1000ml。
[0006] 上述的無菌熱變形小牛血清制備方法為：取無菌小牛血清80°C下加熱lOmin，在 45°C下加入滅菌胰蛋白酶酶解90min，酶與底物的質(zhì)量比為1:150。
[0007] 上述培養(yǎng)基的制備方法為：稱取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化鈉；瓊脂；牛 膽鹽；乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽；γ-氨基丁酸；纈氨酸；L-高精氨酸溶于蒸餾水中，混勻， 121 °C，滅菌15min，冷卻到45°C，加入無菌熱變形小牛血清混勻，滅菌蒸餾水定容到1000 ml 后分裝。
[0008] 所述的胰酪蛋白胨含有多種糖類、氨基酸、維生素和微量元素為壞死梭桿菌生長 提供能量；葡萄糖提供碳源，酵母粉富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、核苷酸、維生素、生長因子、 微量元素等營養(yǎng)成分，促進(jìn)壞死梭桿菌的繁殖和生長；氯化鈉維持均衡的滲透壓；瓊脂為 培養(yǎng)基的凝固劑；γ -氨基丁酸為營養(yǎng)增強劑，促進(jìn)壞死梭桿菌生長。
[0009] 乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽提供壞死梭桿菌生長所需的無機鹽，且該濃度下的乙二胺 四乙酸二鉀鎂鹽會產(chǎn)生下述抑菌滅菌作用：①乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽置換替代革蘭氏陽性 菌中的核糖核酸鎂鹽，導(dǎo)致其不能生成鎂鹽-蛋白質(zhì)復(fù)合物（ribonucleoprotein，RNP)，核 酸編碼的遺傳信息流向活性蛋白質(zhì)的過程受阻，產(chǎn)生針對于革蘭氏陽性菌殺滅作用；②對 于等電點較高的革蘭氏陽性菌，乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽通過電性絡(luò)合作用附著于細(xì)菌細(xì)胞 壁，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形，進(jìn)行發(fā)揮抑菌滅菌作用。而梭桿菌菌屬細(xì)胞壁上的外膜蛋白OMP和 fadA黏附蛋白使得壞死梭桿菌的細(xì)胞壁區(qū)域等電點與乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽不匹配，造成 電性絡(luò)合作用失效，且由于其缺乏核糖核酸鎂鹽，因此抗菌失效。通過實驗分別將咽喉分泌 物標(biāo)本中常見口腔 細(xì)菌化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、凝固酶葡萄球菌、破傷風(fēng)桿菌、壞死梭桿菌菌株接種到 添加 3g/L的乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽⑶C厭氧選擇培養(yǎng)基上，對照組為普通⑶C厭氧菌選擇 培養(yǎng)基，于37°C、厭氧罐內(nèi)培養(yǎng)48h后觀察，添加乙二胺四乙酸二鉀鹽的培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)有壞 死梭桿菌菌落，未發(fā)現(xiàn)化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、凝固酶葡萄球菌菌落、破傷風(fēng)桿菌菌落，對 照組培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、凝固酶葡萄球菌、破傷風(fēng)桿菌和壞死梭桿菌菌 落，由此證實乙二胺四乙酸二鉀鹽對化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、凝固酶葡萄球菌、破傷風(fēng)桿 菌有較好的滅菌作用，且對于壞死梭桿菌無明顯影響。
[0010] 為了取得更好的滅雜菌作用，配方中加入了牛膽鹽，牛膽鹽可以抑制革蘭氏陽性 菌生長，但為了保持適度的電解質(zhì)平衡，且其作用僅僅是對于乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽的滅 菌增效，因此用量濃度比較小。
[0011] 熱變形小牛血清具有選擇性的抗菌效果，其熱變形方法為：取無菌小牛血清80°C 下加熱lOmin，在45°C下加入滅菌胰蛋白酶酶解90min，酶與底物的質(zhì)量比為1:150。熱變 形小牛血清抗菌性質(zhì)針對需氧菌，一方面改變需氧菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，造成通透性增加而死亡， 另一方面可以降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢，促進(jìn)無氧環(huán)境而加速需氧菌死亡，而該種抗菌 作用僅針對于需氧菌，對于厭氧菌則無效。通過實驗將同一大腸桿菌菌株和壞死梭桿菌菌 株分別接種到CDC選擇培養(yǎng)基和配方中添加了 80ml/L的熱變形小牛血清的優(yōu)化CDC選擇 培養(yǎng)基上，于密封干燥缸環(huán)境37°C下培養(yǎng)，24h、48h鑒定，24h時添加熱變形小牛血清大腸 桿菌陽性檢出率為40%，沒有添加熱變形小牛血清的培養(yǎng)基上大腸桿菌陽性檢出率為70% ; 48h檢測結(jié)果為添加熱變形小牛血清的培養(yǎng)基壞死梭桿菌陽性檢出率80%，沒有添加熱變 形小牛血清的培養(yǎng)基上壞死梭桿菌陽性檢出率20% ;由此證實熱變形小牛血清在厭氧缸內(nèi) 對需氧菌有較好的抑制效果，且能通過加速無氧環(huán)境而促進(jìn)厭氧菌生長。
[0012] 纈氨酸為厭氧菌營養(yǎng)劑；L-高精氨酸為激活劑，促進(jìn)纈氨酸的吸收。
[0013] 石菖蒲(學(xué)名：Ac〇rus gramineus)屬菖蒲科，為禾草狀的多年生草本植物，藥用 部分為根莖部位?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研宄表明，石菖蒲含α-細(xì)辛醚等揮發(fā)油及糖類、有機酸、氨基 酸、無機元素等成分，有消腫止痛、化痰開竅、癰疽疥癬等作用，石菖蒲水提液是良好的營養(yǎng) 強化劑，石菖蒲水浸劑（1:3)，在試管內(nèi)對堇色毛癬菌、同心性毛癬菌、星形奴卡菌等皮膚真 菌均有不同程度的抑制作用。有報告指出，石菖蒲煎劑有殺死腹水癌細(xì)胞的作用。Masuda T等研宄發(fā)現(xiàn)石菖蒲中的α-細(xì)辛醚對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌等均有抑制 作用。實驗證實，200g/L濃度下的石菖蒲水煮液對于厭氧菌并無殺滅作用，以厭氧培養(yǎng)基為 對照，以厭氧培養(yǎng)基配方中加入200g/L石菖蒲水煮液為實驗組，接種壞死梭桿菌菌株，96h 的陽性檢出率分別為50%和60%，二者比較無明顯差異（P>0. 05)。
[0014] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有檢出可靠、壞死梭桿菌分離率高的特點。
【具體實施方式】
[0015] 以下結(jié)合實際情況，對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0016] 實施例1，配制1000 ml培養(yǎng)基的配方中含有：胰酪蛋白胨10.0 g ;葡萄糖5. Og ;酵 母粉5. Og ;氯化鈉5. Og ;瓊脂15. Og ;牛膽鹽1.0 g ;乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽3g ; γ -氨基丁 酸〇. Ig ;無菌熱變形小牛血清100mL ;蒸餾水加至1000ml。制備方法：稱取胰酪蛋白胨； 葡萄糖；酵母粉；氯化鈉；瓊脂；牛膽鹽；乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽；γ-氨基丁酸溶于蒸餾水 中，混勻，121 °C，滅菌15min，冷卻到45°C，加入無菌熱變形小牛血清混勻，滅菌蒸餾水