同時鑒別山羊絨和綿羊毛成分的檢測引物、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及紡織品中同時檢測山羊絨和綿羊毛成分的檢測 試劑盒及其檢測方法，尤其涉及利用PCR-DHPLC技術(shù)進行山羊絨和綿羊毛檢測的檢測方法 及所使用的試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)行的纖維檢驗方法不像檢查其他元素一樣可以通過儀器精確檢定，即便在國際 上，也是采用傳統(tǒng)的感官檢驗方法，測試人員通過視覺、觸覺來識別其屬性。對羊毛和羊絨 纖維的鑒別是公認的技術(shù)難度最大的檢測項目。大量的纖維檢測工作者長期以來一直致力 于羊毛與羊絨纖維的鑒別技術(shù)的研宄。目前，鑒別羊絨、羊毛纖維的通用方法是光學投影 顯微鏡法、掃描電鏡法和溶液法等物理方法，都是從纖維的外觀形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)上進行辨 另IJ。但隨著羊毛剝鱗及拉伸等先進技術(shù)的應用，即便是經(jīng)驗豐富的資深檢驗人員有時也難 以準確辨別羊絨和羊毛。采用化學方法通過動物纖維中氨基酸、多肽及脂肪的分析結(jié)果差 異來鑒別鑒別羊絨、羊毛纖維的研宄也有較多的文獻報道，但是這些方法也各有特點，也不 能完全準確鑒定，因為羊絨、羊毛纖維中氨基酸、多肽及脂肪的含量隨加工處理過程、動物 生長環(huán)境和喂養(yǎng)飼料的變化而不同。。顯微鏡法的缺點是檢驗結(jié)果受檢驗人員專業(yè)水準影 響較大，傳統(tǒng)的以經(jīng)驗為主的鑒別方法已不能滿足科學監(jiān)管的需要，對檢測機構(gòu)而言，建立 科學、準確的輕紡產(chǎn)品快速鑒別方法已迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決上述實際問題，本發(fā)明即旨在利用不同動物纖維的遺傳物質(zhì)DNA存在差 異的特性，采用聚合酶鏈式反應PCR和變性高效液相色譜DHPLC技術(shù)，針對紡織品中山羊絨 和綿羊毛的建立特異性引物對，以及靈敏便捷的檢測方法，并建立應用于該方法的快速檢 測試劑盒。涉及同時檢測山羊絨和綿羊毛兩種纖維，應用本發(fā)明的試劑盒，兩種纖維成分可 以經(jīng)過一次PCR反應、一個PCR體系就檢測出來。在一次操作過程中同時檢測羊毛和羊絨 兩種纖維，使得檢測時間、檢測數(shù)量和檢測水平上都發(fā)生了很大的飛躍。本發(fā)明運用變性高 效液相色譜（DHPLC)采用離子對反相高效液相色譜的原理，通過使用特殊的耐高溫液相色 譜分離柱同時采用溫度調(diào)控的方式，對核苷酸片段分子進行分析分離。其快速高通量、全自 動化操作、準確度高、重復性好及敏感性高的優(yōu)點使其在核酸分析中具有無可替代的優(yōu)勢。 與傳統(tǒng)的顯微鏡法相比，本發(fā)明建立的方法及試劑盒，極大縮短了操作的時間，而且大大降 低人為經(jīng)驗因素的影響，使得結(jié)果更加準確、可靠。
[0004] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：提取樣品DNA，以DNA為模板，同時采用山羊絨和綿羊 毛的特異性檢測引物進行PCR擴增，再用DHPLC技術(shù)采集目的基因的圖譜信息，直接從圖譜 信息讀取檢測結(jié)果，在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還對此方法進行了特異性和靈敏度檢測；其具體操 作步驟如下：
[0005] 本發(fā)明的一方面在于：提供一種鑒別山羊絨的檢測引物，一種鑒別綿羊毛的檢測 引物，具體為以下喊基序列：
[0006]
[0007] 本發(fā)明的一方面在于：提供一種同時鑒別山羊絨和綿羊毛成分的檢測試劑盒，其 包括權(quán)利上文所述的引物SEQ ID NO. 1~4。
[0008] 對于上述技術(shù)方案中所述的同時鑒別山羊絨和綿羊毛成分的檢測試劑盒，包括 5U/ μ 1的Taq DNA聚合酶和PCR反應液；分別獨立包裝；其中，所述的PCR反應液為混合液， 包含上文所述的SEQ ID NO. 1~4各ΙΟμΜ之外、還包括IOmM Tris，Cl、50mM KCl、25mM MgC12、dNTP 各 2.5mM。
[0009] 本發(fā)明的另一方面在于：提供一種紡織品中同時鑒別山羊絨和綿羊毛成分的檢測 方法，其利用上述技術(shù)方案所述的檢測試劑盒，對紡織品DNA進行PCR方法檢測。
[0010] 對于上述技術(shù)方案中所述的紡織品中同時鑒別山羊絨和綿羊毛成分的檢測方法， 其包括以下操作步驟：分別對樣品按下述方法進行PCR檢測：
[0011] ① PCR反應體系為50 μ 1，其中：樣品DNA 4 μ 1、5U/μ 1的Taq DNA聚合酶0.4 μ 1、 PCR反應液24 μ 1、滅菌超純水21. 6 μ 1。
[0012] ②PCR反應條件：預變性：94°C，3min ;進入循環(huán)：94°C變性30s，56°C退火30s， 72°C延伸30s，35次循環(huán)；終止延伸：72°C，7min。
[0013] 對于上述技術(shù)方案中所述的紡織品中同時鑒別山羊絨和綿羊毛成分的檢測方法， 其操作步驟中，還可以包括如下步驟：
[0014] 對上文所述的山羊絨和綿羊毛成分PCR檢測方法獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行DHPLC 分析。
[0015] DHPLC工作原理：DHPLC采用高壓閉合液相流路，將DNA樣品自動注入并在緩沖液 攜帶下流過待測DNA樣品分離柱，通過緩沖液的不同梯度變化，在不同分離柱溫度條件下 實現(xiàn)對待測DNA樣品不同的分析；由紫外檢測或熒光檢測被分離的DNA樣品。
[0016] DHPLC分析步驟：
[0017] 色譜柱：PS-DVB&C18DNAS印色譜柱（4. 6mmX 50mm，粒度 3 μ m);
[0018] 柱溫：50°C ;
[0019] 流動相（體積比）：0· Omin，48. 0 %緩沖溶液A，52. 0 %緩沖溶液B ;
[0020] 0.511^11，42.9%緩沖溶液六，57.1%緩沖溶液8;
[0021] 3. 6min，38. 8%緩沖溶液 Α，61· 2%緩沖溶液 B ;
[0022] 6. 8min，36. 6 %緩沖溶液 Α，63. 4%緩沖溶液 B
[0023] 9. 9min，35. 2 %緩沖溶液 A，64. 8 %緩沖溶液 B ;
[0024] 1311^11，34.3%緩沖溶液4,65.7%緩沖溶液8;
[0025] 其中，緩沖溶液A為50ml TEAA和250 μ 1乙腈混合，加滅菌超純水定容至1000 ml 所得溶液；緩沖溶液B為50ml TEAA和250ml乙腈混合，加滅菌超純水定容至1000 ml所得 溶液；
[0026] 流速：0· QmT ,/mi η ；
[0027] 檢測器：熒光檢測器（光源：150W Xenon燈；激發(fā)譜帶寬：15nm;發(fā)射譜帶寬： 15. 3nm ;檢測靈敏度：在波長350nm積分2s ;
[0028] 上樣量：PCR產(chǎn)物5yL。
[0029] 檢測結(jié)束后，根據(jù)DHPLC檢測圖譜中特征色譜峰的峰形，保留時間以及與陽性對 照圖譜的對照，來確定樣品中是否含有山羊絨和綿羊毛。
[0030] 檢測過程中可以設陽性對照和陰性對照。陽性對照為山羊絨DNA和綿羊毛DNA，陰 性對照為非目標纖維的DNA。
[0031] 陰性對照：在上述DHPLC條件下，無吸收峰出現(xiàn)；
[0032] 陽性對照：在上述DHPLC分析條件下，綿羊毛在約4. Omin出現(xiàn)PCR產(chǎn)物吸收峰；山 羊絨在約6. 7min出現(xiàn)PCR吸收峰。且以上典型的PCR產(chǎn)物吸收峰值大于2mV ;
[0033] 在上述DHPLC分析條件下，約4. Omin出現(xiàn)PCR產(chǎn)物吸收峰，為樣品中含有綿羊毛 成分；約6. 7min出現(xiàn)PCR吸收峰，為樣品中含有山羊絨成分。
[0034] 有益效果：使用本發(fā)明的檢測試劑盒及檢測方法，可以高靈敏度地鑒別紡織品中 的山羊絨和綿羊毛成分，檢測耗時短，操作簡捷，可以節(jié)省大量的勞力物力，適合快速檢測 的要求。該方法的研制成功及推廣應用對提高動物纖維的鑒別效率及靈敏度，提高檢驗技 術(shù)具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0035] 圖1為山羊絨的特異性試驗結(jié)果圖。
[0036] 圖2為綿羊毛的特異性試驗結(jié)果圖；
[0037] 圖3為樣品中同時含有山羊絨和綿羊毛的特異性試驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0038] 下述非限制性實施例，其對本方法的建立及其應用作進一步的說明，可以使本領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0039] 若無特殊說明，本部分所使用的主要試劑、儀器均由商業(yè)途徑獲得，部分商品來源 為：DNA提取試劑盒（組織和毛發(fā)提取試劑盒，Promega公司）；Taq酶及PCR反應液等試劑 均購自寶生物工程（大連）有限公司；三乙胺乙酰鹽（TEAA，色譜純）購自Transgenomic公 司；乙腈（色譜純）購自Fisher公司；普通PCR儀PE24000 (PerkinElmer公司，美國）；變 性高效液相色譜儀NAV-99-4500 (Transgenomic公司，美國）。
[0040] 實施例1
[0041] 1.模板的制備
[0042] 下述模板DNA提取方法，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，所有試劑及溶液均