用于檢測雞生長性狀的試劑盒及雞的分子育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測雞生長性狀的試劑盒，同時還涉及一種基于雞 miRNA-1687基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會經(jīng)濟的迅速發(fā)展和人們生活水平的提高，市場對肉質(zhì)的需求整體上從以 前的數(shù)量要求轉(zhuǎn)向了對質(zhì)量風(fēng)味的追求。生長性狀、體尺性狀、肉質(zhì)性狀和屠體性狀是當(dāng)今 家禽工業(yè)最關(guān)注的經(jīng)濟性狀。大多數(shù)的經(jīng)濟性狀屬于數(shù)量性狀，主要是由為數(shù)眾多的微效 基因決定的，這些基因同時具有加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)和上位效應(yīng)，復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)是由 影響該表型的遺傳因素和環(huán)境因素以及它們之間的相互作用共同決定的。國內(nèi)優(yōu)質(zhì)地方雞 普遍存在生長速度緩慢的問題，從而影響了經(jīng)濟效益。因此，多年來研宄人員試圖通過大量 的試驗尋找與雞的相關(guān)經(jīng)濟性狀相關(guān)的候選基因，為家禽分子選種育種方面提供輔助標(biāo)記 選擇。
[0003] 應(yīng)用分子標(biāo)記的現(xiàn)代育種技術(shù)是加快良種選育和提高種群遺傳品質(zhì)的重要途徑。 應(yīng)用分子標(biāo)記育種首先是在DNA水平上篩查和檢測與雞經(jīng)濟性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其 次是建立其基因多態(tài)性的快速檢測方法，然后實現(xiàn)遺傳標(biāo)記輔助選擇和實現(xiàn)早期診斷選 擇。
[0004] 單核苷酸多態(tài)（Single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因組水平上由 于單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP可以在DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平影響基 因的功能，是人類可遺傳變異最常見的一種，占已知多態(tài)性的90 %以上。對基因產(chǎn)物有影響 的SNP的功能進行分析，其意義十分重大。SNP多樣性與經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)分析一直是畜禽遺 傳學(xué)研宄的熱點。隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)及其研宄的深入，研宄者發(fā)現(xiàn)miRNA不僅參與了動物 復(fù)雜性狀表型形成的分子調(diào)控過程，而且其SNP變化還可能導(dǎo)致miRNA功能異常，進而引起 生物表型性狀的變異。miRNA相關(guān)多態(tài)的形成機制包括插入、缺失、易位、擴增以及堿基替 換。miRNA的多態(tài)性是影響miRNA調(diào)節(jié)功能的重要因素。單個miRNA表達異常時，可能影響 數(shù)百種靶基因的表達，當(dāng)其中某些關(guān)鍵蛋白表達量降低時，會導(dǎo)致機體生理功能異常和疾 病發(fā)生。研宄發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在miRNA初級產(chǎn)物、前體及成熟體上的多態(tài)性會潛在的影響數(shù)以百 計基因的表達和通路，從而廣泛影響miRNA的功能。
[0005] SNP多態(tài)性的檢測方法，最常見的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)（SSCP)、PCR-RFLP和直接 測序技術(shù)等。但SSCP操作繁瑣、耗時長，影響因素多，且實驗過程中存在假陰性問題，所以 并非理想的SNP檢測手段；直接測序技術(shù)成本較高。許多研宄運用了 PCR-RFLP方法或PCR 與聚丙烯酰胺電泳檢測相結(jié)合的方法。
[0006] MassARRAY系統(tǒng)進行SNP分型的基本原理是以基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì) 譜（MALDI-T0F MS)技術(shù)結(jié)合單引物延伸反應(yīng)，通過對核酸片段分子量直接鑒定而實現(xiàn)的。 引物序列經(jīng)合成、稀釋后首先進行多重PCR擴增，以增加單堿基延伸反應(yīng)的模板，然后再進 行單堿基延伸反應(yīng)，單堿基延伸反應(yīng)中所用為ddNTP，因此延伸一個堿基后反應(yīng)自動終止。 最后將延伸產(chǎn)物利用全自動點樣機加到芯片上，通過MassARRAY進行質(zhì)譜分型。MASSARRAY 平臺檢測SNP具有以下優(yōu)勢：準(zhǔn)確可靠，直接對分子量進行檢測，不涉及熒光標(biāo)記、凝膠電 泳等，就能檢測一個堿基的差異，準(zhǔn)確性高，機器本身出錯的概率非常低，無需再次驗證，也 無需設(shè)計統(tǒng)計學(xué)重復(fù)。通量較高，可以適用于對幾個到幾百個SNP位點的檢測。檢測時間 短，利用質(zhì)譜檢測在40min內(nèi)就可以完成對380個樣本的檢測，并且實時顯示檢測結(jié)果。
[0007] 公告號CN103710427B的發(fā)明專利公開了一種基于雞miRNA-1704基因單核苷酸 多態(tài)性的分子育種方法，包括以下步驟：（1)以包含miRNA-1704基因的雞全基因組DNA為 模板，設(shè)計一對引物；（2)以引物對P為引物，PCR擴增雞miRNA-1704基因；（2)用限制性 內(nèi)切酶EcoR I消化PCR擴增產(chǎn)物，再對酶切后的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝 膠電泳結(jié)果鑒定雞miRNA-1704基因序列中第148位的單核苷酸多態(tài)性：當(dāng)雞miRNA-1704 基因的第148位點為G時，酶切后電泳圖譜為兩條帶，條帶大小為184bp和148bp，命名為 GG基因型；當(dāng)雞miRNA-1704基因的第148位點為C時，酶切后電泳圖譜為一條帶，條帶大 小為332bp，命名為CC基因型；當(dāng)雞miRNA-1704基因的第148位點為雜合的個體時，酶切 后電泳圖譜為三條帶，條帶大小為332bp，184bp和148bp，命名為GC基因型；通過將基因 型與雞的生長性狀進行關(guān)聯(lián)性分析，確定基因與性狀的對應(yīng)關(guān)系，用于雞的分子育種；雞 miRNA-1704基因第148位的單核苷酸多態(tài)性中CC基因型作為雞體重性狀的標(biāo)記輔助選擇 育種中提高雞體重的分子遺傳標(biāo)記。然而，在該方法中miRNA-1704SNP與雞初生重、2周齡 體重、4周齡體重之間的差異不顯著，從6周齡時開始差異顯著，考慮到目前集約化養(yǎng)殖雞 的生長周期為50天左右，該方法不利于盡早進行選留。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測雞生長性狀的試劑盒。
[0009] 同時，本發(fā)明還提供一種基于雞miRNA-1687基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方 法。
[0010] 為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0011] 用于檢測雞生長性狀的試劑盒，包括：
[0012] 上游引物 F PRimer :5' -ACGTTGGATGTGAACAGCAACACAGCTAGG-3'（如 SEQ ID NO. 1 所示），
[0013] 下游引物 R PRimer :5' -ACGTTGGATGAGCAACTTCTTTGCTGGCTG-3'（如 SEQ ID NO. 2 所示）；
[0014] 單堿基延伸引物：5' -AGTGACTGCAGCATAAAAA-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示）。
[0015] 上述試劑盒還可以包括：10Xbuffer、Mg2+、dNTP、Hotstar、iPLEX終止反應(yīng)Mix、單 堿基延伸酶、SAP buffer、SAP酶、ddd H2O及DNA Marker等。試劑盒中上述組分的添加量 可適當(dāng)選取，如大于10次的用量。
[0016] -種基于雞miRNA-1687基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方法，包括以下步驟：
[0017] 1)提取雞總DNA，加入引物進行PCR擴增；
[0018] 2)加入單堿基延伸引物進行單堿基延伸反應(yīng)，得反應(yīng)產(chǎn)物；
[0019] 3)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)飛行質(zhì)譜檢測后，選留GG基因型的公母雞個體，建立目標(biāo)雞群。
[0020] 步驟1)中引物如下：
[0021] 上游引物 F PRimer :5' -ACGTTGGATGTGAACAGCAACACAGCTAGG-3'，
[0022] 下游引物 R PRimer :5' -ACGTTGGATGAGCAACTTCTTTGCTGGCTG-3' ；
[0023] 步驟 2)中單堿基延伸引物為：5' -AGTGACTGCAGCATAAAAA-3'。
[0024] 步驟1)中PCR擴增的反應(yīng)體系為：總計5. 0 μ I ;10Xbuffer 0· 5 μ 1，25mM Mg2+O. 4 μ 1，25mM dNTP 0·I μ 1，5U/μ I Hotstar 0·2 μ 1，IOpmol/μ I F Primer/R Primer 各 0· 5 μ 1，IOOng/ μ 1 總 DNAL 0 μ 1，ddd H2O I. 8 μ 1。
[0025] 步驟1)中PCR擴增的反應(yīng)程序為：預(yù)變性95 °C 2min ;95 °C 30s ;56 °C 30s ; 72°C 60s，45 個循環(huán)；72°C 5min ;25°C保溫。
[0026] 步驟I)中PCR擴增后一般需加入堿性磷酸酶（SAP)去除剩余的dNTP，SAP酶消化 為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。在本發(fā)明中，SAP酶消化體系為：總計2. 0 μ I ;SAP buffer 0. 17 μ 1， I. 7U/ μ I SAP酶0· 3 μ l，ddd H2O I. 53 μ I ;SAP酶消化程序為：37°C 40min ;85°C 5min ;25°C 保溫。
[0027] 步驟2)中單堿基延伸反應(yīng)的反應(yīng)體系為：總計2.0μ1 ;10Xbuffer 0.2μ1， 反應(yīng)濃度為I X iPLEX終止反應(yīng)Mix 0. 2 μ 1，7 μ M單堿基延伸引物0. 94 μ 1，反應(yīng)濃度為 IXiPLEX 單堿基延伸酶(λ 041 μ 1，ddd H2O 0.619 μ 1。
[0028] 步驟2)中單堿基延伸反應(yīng)的反應(yīng)程序為：預(yù)變性94°C 30s ;40個循環(huán)：94°C 5s， 52°〇58,80°〇58\5個內(nèi)部循環(huán)，72°〇311^11;25°〇保溫。
[0029] 步驟3)中反應(yīng)產(chǎn)物先用樹脂脫鹽，再點樣于芯片，芯片用基質(zhì)輔助激光解吸附電 離飛行時間質(zhì)譜檢測。
[0030] 本發(fā)明的有益效果：
[0031] 本發(fā)明采用MassARRAY系統(tǒng)基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合單 引物延伸反應(yīng)，對固始雞和安卡雞F 2代資源群進行miRNA-1687 (rsl5179830G/T) SNP位點 基因分型，并與F2代資源群生長性狀關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明雞miRNA-1687基因 SNP單核苷酸 多態(tài)性與不同發(fā)育階段的體重關(guān)聯(lián)顯著（與雞的初生重、4周齡體重、6周齡體重、8周齡體 重和10周齡體重存在顯著相關(guān)（P〈〇. 05))，