一種毛竹油菜素內(nèi)酯受體蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種毛竹油菜素內(nèi)酯受體蛋白及其編碼 基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 油菜素內(nèi)酯是一種重要的天然植物激素，作用機理類似于生長素，它能充分激發(fā) 植物內(nèi)在潛能，促進作物生長和增加作物產(chǎn)量。植物細胞的伸長速率決定著植物的生長速 度，研究表明油菜素類固醇物質(zhì)（brassinosteroids，BRs)在棉花纖維發(fā)育中具有重要作 用，大田施用油菜素內(nèi)酯（brassinolide，BL)，一種生物活性最高的BRs，可以使纖維長度 提高6. 1%，纖維強度提高9. 5%。BRs發(fā)揮活性主要是通過與細胞膜上的受體結(jié)合來實現(xiàn)其 功能的，因此對細胞膜上BRs受體蛋白進行研究，有助于揭示BRs的作用機制。
[0003] 竹子作為我國重要的森林資源，生長速度快，竹筍出土到長成新竹僅需40-50 天，4年生達到材性最佳；繁殖能力強，一次造林，青山常在，永續(xù)利用（每年砍伐竹林中 的1/5-1/4);較耐瘠薄，適宜山地造林，尤其是我國造林宜林地日趨減少的情況下，竹林 優(yōu)勢更為明顯。因此竹資源開發(fā)利用已成為解決我國林農(nóng)民生問題的重要途徑。毛竹 (Phyllostachys edulis)是我國重要的輿材兩用竹種之一,速生的特點一直倍受關(guān)注，以 毛竹為材料進行油菜素內(nèi)酯受體蛋白基因的研究，對于解析毛竹速生機制、更好地開發(fā)利 用毛竹基因資源具有重要的現(xiàn)實意義。
[0004] 然而，竹子油菜素類固醇物質(zhì)及其受體蛋白的研究尚屬空白。因此，本發(fā)明從毛竹 中克隆得到的油菜素內(nèi)酯受體蛋白基因具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明的目的是提供一種毛竹油菜素內(nèi)酯受體蛋白及其編碼 基因。
[0006] 本發(fā)明提供的毛竹油菜素內(nèi)酯受體蛋白，來源于毛竹（Phyllostachys edulis), 選自如下a)或b):
[0007] a)由如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008] b)將SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失、或添加一個或幾個氨基酸殘基 形成的具有同等功能的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 該蛋白的等電點為8. 337,分子量為64. 915KDa。第55-200位為黃素腺嘌呤二核 苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide，F(xiàn)AD)結(jié)合區(qū)保守域，多結(jié)構(gòu)域分析顯示該蛋白具有 FAD內(nèi)酯氧化酶（FAD Lactone oxidase)的性質(zhì)。
[0010] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的油菜素內(nèi)酯受體蛋白氨基酸序列（SEQ ID No. 1)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白 的突變序列。因此，本發(fā)明油菜素內(nèi)酯受體蛋白還包括SEQ ID No. 1所示氨基酸序列經(jīng)取 代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有與毛竹油菜素內(nèi)酯受體蛋白同等功能的由毛 竹油菜素內(nèi)酯受體蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。 [0011] 本發(fā)明提供的編碼基因為如下1)或2)的基因：
[0012] 1)其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
[0013] 2)其核苷酸序列是SEQ ID NO. 2的自Y末端第172-1857位核苷酸所示。
[0014] SEQ ID NO. 2所示的基因全長為2093bp，分析表明，該序列包含一個完整的編碼區(qū) 1686bp，5 ^非翻譯區(qū)（UTR)171bp，3 ^非翻譯區(qū)212bp和polyA尾巴24bp，編碼561個氨基 酸組成的蛋白，如SEQ ID NO. 1所示。實驗表明，該基因在水稻矮化突變體Fnl89中過量表 達，轉(zhuǎn)基因水稻的株高恢復(fù)如野生型水稻，與Fnl89相比，纖維細胞顯著增長。由此表明該 基因具有促進植物細胞生長的功能。
[0015] 此外，本發(fā)明所述編碼基因還包括由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失 和/或增加一個或幾個核苷酸，得到編碼毛竹油菜素內(nèi)酯受體蛋白的核苷酸序列。
[0016] 含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒均屬于 本發(fā)明的保護范圍。
[0017] 所述重組載體為如下I )或II )的重組質(zhì)粒：
[0018] I )將權(quán)利要求2或3所述基因插入PCAMBIA1301載體多克隆位點得到的重組質(zhì) 粒；
[0019] II)將權(quán)利要求2或3所述基因插入pET30a載體多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。
[0020] 在本發(fā)明實例中，所述毛竹油菜素內(nèi)酯受體蛋白基因命名PeCE，通過如下方法克 隆獲得：從毛竹根系EST文庫中得到一個片段，分析發(fā)現(xiàn)該片段為包含5'端cDNA序列，編 碼的片段屬于油菜素內(nèi)酯受體蛋白（部分片段)。根據(jù)油菜素內(nèi)酯受體蛋白基因家族的保守 區(qū)設(shè)計引物，以毛竹根系的cDNA為模板，通過RT-PCR的方法先克隆到T-easy載體上，并對 篩選出的陽性克隆子進行測序克隆分析，發(fā)現(xiàn)插入片段與油菜素內(nèi)酯受體蛋白基因家族的 保守區(qū)有著較高的相似性。根據(jù)已獲得保守區(qū)片斷的序列設(shè)計引物，進行3' -RACE擴增， 將PCR產(chǎn)物回收、連接后轉(zhuǎn)化，在得到的大量克隆中，選取陽性克隆進行測序。通過測序并 與保守區(qū)序列、5'端序列拼接，去掉重疊部分，得到全長基因序列2093bp。
[0021] 將本發(fā)明基因與表達載體可操作地連接，得到能夠表達本發(fā)明基因的過量表達載 體，進一步將該表達載體導(dǎo)入恰當?shù)乃拗骷毎?，獲得表達本發(fā)明PeCE基因的工程菌。
[0022] 在本發(fā)明實例中，根據(jù)PeCE編碼區(qū)序列設(shè)計包含酶切位點的引物，通過RT-PCR的 方法先克隆到T-easy載體上，測序正確后將PeCE克隆到植物表達載體pCAMBIA1301的多 克隆位點，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,侵染水稻突變體Fnl89的愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
[0023] 本發(fā)明的另一目的是提供的基因在促進植物莖桿生長中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：提供了一種新的油菜素內(nèi)酯受體蛋白基因，能夠?qū)崿F(xiàn)水稻矮 化突變體Fnl89的株高恢復(fù)到野生型的正常表型，為植物速生育種提供了新的基因資源， 將在竹子等禾本科植物育種中具有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0025] 圖1為保守區(qū)擴增產(chǎn)物電泳圖；
[0026] 圖2為:V -RACE擴增產(chǎn)物電泳圖；
[0027] 圖3為植物表達載體PeCE sense的質(zhì)粒載體圖；
[0028] 圖4為單克隆菌落PCR電泳結(jié)果，其中，1-4 :單克隆菌落；5 :重組表達載體質(zhì)粒； 6 :水；M :DNA分子量標記；
[0029] 圖5為轉(zhuǎn)PeCE基因植株RT-PCR檢測，其中，1-2 :轉(zhuǎn)基因植株；3 :野生型；4 :矮化 突變體；5 :水；M :DNA分子量標記；
[0030] 圖6為水稻株高表型，其中，a :矮化突變體Fnl89 ;b :野生型水稻；c :以矮化突變 體Fnl89為受體轉(zhuǎn)化PeCE基因的轉(zhuǎn)基因植株；
[0031] 圖7為水稻株高統(tǒng)計，其中，MT :矮化突變體；Iine-I和line-2 :轉(zhuǎn)基因株系；WT : 野生型；
[0032] 圖8為水稻纖維細胞長度統(tǒng)計，其中，1 :水稻轉(zhuǎn)PeCE基因植株；2 :水稻矮化突變 體；3 :野生型水稻；
[0033] 圖9為重組表達載體pET30a_PeCE的質(zhì)粒載體圖；
[0034] 圖10為重組蛋白純化的SDS-PAGE檢測圖，其中，I :pET30a對照；2 :誘導(dǎo)表達 pET30a-PeCE融合蛋白；3 :未誘導(dǎo)pET30a-PeCE表達的融合蛋白；4 :純化的pET30a-PeCE融 合蛋白；M :蛋白分子量標記。
【具體實施方式】
[0035] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0036] 實施例1毛竹油菜素內(nèi)酯受體蛋白基因 PeCE序列的獲得
[0037] 以毛竹（Phyllostachys edulis)根系為材料，提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模 板。從本實驗室建立的毛竹根系cDNA文庫EST序列中獲得油菜素內(nèi)酯受體蛋白基因的Y 端cDNA序列723bp，根據(jù)該序列以及水稻同源序列3'端序列設(shè)計引物，PCR擴增編碼區(qū)序 列。
[0038] 上游引物：5' -ATGCCGGATCTTCAGGAACCCCT-3' ；
[0039] 下游引物：5，-CGCCTCATCAGCGTAGGCTGGC-3'。
[0040] 對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1所示，約I. 6kb處有一條亮帶， 切下目的條帶純化回收，將回收的DNA片段連接到pGEM-T easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (Esherichia coli)DH5a感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選，提取陽性克隆質(zhì)粒并酶切圖譜分析 后，再將單克隆測序，插入片段為1679bp。應(yīng)用Blast在線軟件，將測序的序列與已報道的 基因進行同源比較，發(fā)現(xiàn)插入片段與油菜素內(nèi)酯受體蛋白基因家族的保守區(qū)有著較高的一 致性。
[0041] 為驗證3'端，獲得全長CDNA序列，根據(jù)已獲得保守區(qū)片段的序列設(shè)計3' -RACE 引物：
[0042] PeCE3-l:5， -GCCACCCAGGGGGAATCTATCAGGAAC-3，；
[0043] PeCESUi -TGAGCACCACCACAGGCAAGGCGACAC-3'。
[0044] 引物PeCE3_l和通用引物UPM的產(chǎn)物電泳呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，沒有特異性條帶，將PCR 產(chǎn)物稀釋50倍作為模板，用引物PeCE3-2與通用引物NUP配對進行擴增，電泳結(jié)果顯示約 在0.6kb有一條亮帶，如圖2所示。將PCR產(chǎn)物回收、連接后轉(zhuǎn)化，在得到的大量克隆中，選 取陽性克隆進行測序獲得序列603bp。通過測序并于保守區(qū)序列拼接，去掉重疊部分，得到 脫氧核糖核苷酸序列全長為2093bp，該基因命名為PeCE，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所 示，包含一個完整的編碼區(qū) 1686bp，5'非翻譯區(qū)（UTR)171bp，3'非翻譯區(qū)212bp和polyA 尾巴24bp。
[0045] 通過blast軟件在線比較分析，發(fā)現(xiàn)PeCE編碼的氨基酸序列與