同時(shí)提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于污水處理技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物胞內(nèi)和胞外DNA的提取方法，尤其是 涉及一種同時(shí)提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 通過(guò)微生物降解可溶性和懸浮性有機(jī)污染物是目前污水處理廠的核心工藝，最有 代表性的即活性污泥法。只要為微生物提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，微生物充分生長(zhǎng)，就可以最大 限度的去除有機(jī)污染物，提高出水水質(zhì)。換言之，微生物的數(shù)量和類別直接決定了污水生物 處理的效果。而污水中微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，傳統(tǒng)的微生物純種培養(yǎng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且效果 不佳，故目前關(guān)于環(huán)境微生物的研宄大都采用以DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)研宄。同時(shí)， 盡管胞外DNA在水體中數(shù)量極低且容易分解，一些胞外DNA也被發(fā)現(xiàn)對(duì)于環(huán)境微生物群體 和污水處理效果有重要作用。當(dāng)前胞外DNA對(duì)環(huán)境的影響越來(lái)越受到重視，但是胞外DNA 提取工藝的研宄很少，特別針對(duì)污水生物處理水樣同時(shí)提取其中胞內(nèi)胞外DNA的方法更是 未見報(bào)道。
[0003] 現(xiàn)有活性污泥DNA提取的方法中，一般是通過(guò)簡(jiǎn)單的污水水樣預(yù)處理（如離心、 過(guò)濾）等收獲微生物泥渣，然后采用溶菌酶、珠磨、凍融等手段破胞釋放胞內(nèi)DNA，再進(jìn)一步 提取純化（王愛(ài)杰，張運(yùn)晴，闞洪靜，劉充.一種厭氧活性污泥DNA的提取方法[P].中國(guó)， 2009: CN101392248A ;趙曉祥，張灣，鄧航.一種SBR中活性污泥樣品DNA的提取方法[P].中 國(guó)，2013義附032152544)，這時(shí)甚至可以使用一些市售的0嫩提取試劑盒。這樣的污泥0嫩 提取流程，并沒(méi)有特別考慮胞外基因問(wèn)題，胞外DNA被當(dāng)作雜質(zhì)在預(yù)處理過(guò)程中被清除，或 者僅提取樣品總DNA不區(qū)分來(lái)源于胞內(nèi)或胞外。因此，若要同時(shí)提取污水水樣中的胞內(nèi)和 胞外DNA，面臨很多困難，首先污水生物處理中的水樣，除了含有微生物絮體，還有其他一些 固體雜質(zhì)，胞外DNA分子容易吸附在這些固體顆粒上，很難獲得。其次，如同時(shí)提取污水水 樣中的胞內(nèi)胞外DNA，還需防止污水微生物細(xì)胞裂解后的胞內(nèi)DNA污染胞外DNA。
[0004] 但目前尚未見適于同時(shí)提取污水生物處理水樣中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種適用于從污水生物降解工藝過(guò)程中的水樣同時(shí)提取 其中微生物胞內(nèi)和胞外DNA的方法。
[0006] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0007] 1、預(yù)處理
[0008] 取污水樣品10mL，加入NaH2PO4溶液和聚乙烯基吡咯烷酮，常溫條件下放置搖床震 蕩混勻，得預(yù)處理樣品；
[0009] 2、分離胞內(nèi)和胞外DNA
[0010] 1)將步驟1預(yù)處理所得樣品進(jìn)行離心，得到沉淀物A和上清液A ;
[0011] 2)將步驟1)所得沉淀物A重懸于NaH2PO4溶液中，得重懸液A ;
[0012] 3)將步驟1)所得上清液A用無(wú)菌濾膜過(guò)濾，收集濾液放冰盒內(nèi)保藏，含截留物的 濾膜重懸于NaH 2PO4溶液中震蕩，濾膜洗脫截留物后棄除，得重懸液B ;
[0013] 4)合并重懸液A和重懸液B，再重復(fù)步驟1)~3)，得到重懸液C，另將冰盒內(nèi)保藏 的樣品合并得總濾液；
[0014] 5)將重懸液C和總濾液分別進(jìn)行離心，分別得到沉淀物Bl和沉淀物B2,以及上清 液Bl和上清液B2 ;將沉淀物Bl和沉淀物B2合并，得沉淀物C，沉淀物C用于提取胞內(nèi)DNA， 將上清液Bl和上清液B2合并，得上清液C，上清液C用于提取胞外DNA ;
[0015] 3、提取純化胞內(nèi)DNA
[0016] 1)將沉淀物C加入DNA提取緩沖液和玻璃珠，渦旋震蕩，然后加入SDS緩沖液，得 混合液；
[0017] 2)將步驟1)得到的混合液采用凍融法破胞，即將混合液交替進(jìn)行液氮浴和水浴， 然后進(jìn)行離心，離心后所得上清液D置于冰盒內(nèi)保藏，離心后所得沉淀物D重懸于DNA提取 緩沖液中，得重懸液D ;
[0018] 3)將重懸液D進(jìn)行渦旋震蕩后水浴，再加入SDS緩沖液，然后水浴，接著離心，將離 心后所得上清液E置于冰盒內(nèi)保藏；
[0019] 4)對(duì)上清液E采用商用試劑盒純化DNA，得到胞內(nèi)DNA ;
[0020] 4、提取純化胞外DNA
[0021] 將步驟2中的步驟5)所得上清液C加入CTAB后水浴，接著離心，離心后轉(zhuǎn)移上清 液，然后利用商用試劑盒純化其中DNA，得到胞外DNA。
[0022] 下面進(jìn)一步給出較佳的附加技術(shù)條件：
[0023] 在步驟1中，所述NaH2PO4溶液為0· 12M，pH 8. 0 ;NaH 2P04溶液加入量9~I ImL ;所 述聚乙烯基吡咯烷酮加入量為0. 5~I. 5g。
[0024] 在步驟2中，所述NaH2PO4溶液為0. 12M，pH 8. 0 ;所述無(wú)菌濾膜的孔徑為 彡0. 22 μ m ;所述重復(fù)步驟1)~3)的次數(shù)可為1~5次；所述離心的條件為：離心溫度4°C， 離心力^ 10000g，離心時(shí)間10~20min。
[0025] 在步驟3中，其中步驟1)使用的DNA提取緩沖液成分包括IOOmM Tris-HClUOOmM Na2-EDTA、100mM Na3P04、l. 5M NaCl、l% CTAB 以及0· 001 ~0· lmg/mL蛋白酶K ;DNA提取緩 沖液的加入量是3~5mL ;所述玻璃珠的直徑為1mm，玻璃珠加入量是0. 5~Ig ;所述SDS緩 沖液為濃度10% SDS緩沖液，10% SDS緩沖液加入量為1~3mL ;其中步驟2)所述將混合 液交替進(jìn)行液氮浴和水浴的次數(shù)可為1~5次；所述液氮浴的時(shí)間為lmin，水浴的溫度為 60°C，水浴的時(shí)間為20min ;所述離心的條件為：離心溫度4°C，離心力彡13000g，離心時(shí)間 彡20min ;其中步驟3)所述渦旋震蕩的轉(zhuǎn)速為2500rpm，時(shí)間為5min，水浴的溫度為37°C， 水浴的時(shí)間為2h ;所述SDS緩沖液為濃度10% SDS緩沖液，10% SDS緩沖液加入量是1~ 3mL〇
[0026] 在步驟4中，所述CTAB的濃度為1 % (w/v)，1 % CTAB的加入量與上清液C的體積 比為I : 1;水浴的溫度為65°C，水浴的時(shí)間為30min;所述離心的條件為：離心溫度4°C， 離心力^ l3〇OOg，離心時(shí)間^ 2〇min。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的有益效果如下：
[0028] 本發(fā)明可以從活性污泥法等生物處理污水樣品中同時(shí)提取胞內(nèi)和胞外DNA并進(jìn) 行準(zhǔn)確定量，收率高，純度高，并且菌體裂解的交叉污染小，簡(jiǎn)單易行，非常適合對(duì)含大量微 生物的污水樣品進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)和科學(xué)研宄使用，也具有開發(fā)加工成商業(yè)分析試劑盒的應(yīng)用 前景。在步驟1中加入NaH 2PO4和聚乙烯基吡咯烷酮，不僅可以去除腐殖酸等雜質(zhì)，而且對(duì) 菌體細(xì)胞有保護(hù)緩沖作用，防止細(xì)胞裂解造成胞內(nèi)DNA污染胞外DNA。解決了目前胞外DNA 容易被胞內(nèi)DNA污染，不宜獲得的難題。在其它步驟中使用離心和過(guò)濾等物理手段，可避免 使用化學(xué)方法對(duì)DNA造成污染，同時(shí)NaH 2PO4溶液對(duì)菌體細(xì)胞有保護(hù)緩沖作用。在步驟3中 的步驟1)中使用的SDS緩沖液對(duì)污水中高濃度的菌體有很好的裂解效果，充分提高了 DNA 的回收率。步驟4提取胞外DNA過(guò)程中采用CTAB法，未添加其他對(duì)DNA有吸附作用的物質(zhì)， 利用高速離心一次性沉淀雜質(zhì)，充分避免了胞外DNA的損失。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。在圖1中，泳道1是胞內(nèi) DNA，泳道2是胞外DNA。
[0030] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例2提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。在圖2中，泳道1是胞內(nèi) DNA，泳道2是胞外DNA。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 利用膜生物反應(yīng)器（membrane bioreactor, MBR)處理生活污水時(shí)，分析膜生物反 應(yīng)器內(nèi)部水樣的胞內(nèi)和胞外DNA含量。
[0034] 使用8L浸沒(méi)式中空纖維膜MBR，連續(xù)曝氣200L/h，HRT為24h，污泥負(fù)荷0. 24kg COD/kg VSS ·(!，常溫下穩(wěn)定運(yùn)行。取IOmL MBR內(nèi)部混合液進(jìn)行提DNA操作，混合液樣品含 較多活性污泥，顏色為淺褐黃色。
[0035] MBR混合液中加入IOmL似&?04溶液（0· 12M，pH 8. 0)和Ig聚乙烯基吡咯烷酮 (Polyvinylpolypyrrolidone, PVPP)