一種檢測水體類金屬砷的微生物學(xué)方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種檢測水體中類金屬砷的微生物學(xué)方法，具體涉及利用基因工程改造的大腸埃希氏菌報告菌株的構(gòu)建方法，及建立其在檢測水體環(huán)境中類金屬砷的方法。【
背景技術(shù)：
】[0002]砷，是廣泛分布于自然界的非金屬元素。地殼中的含量約為2~5mg/kg，為構(gòu)成地殼元素的20位。類金屬砷是被國際癌癥研宄署（IARC)歸類為一級的人類致癌物。世界不同地區(qū)的21個國家受到了砷污染的影響，最大的風(fēng)險群體來自孟加拉國，其次是印度的西孟加拉國，中國也是砷危害最重的國家之一。水體類金屬砷污染已經(jīng)在我國局部地區(qū)表現(xiàn)為公害?。ㄈ鐝V東英德市橫石塘鎮(zhèn)龍新村嶺下村組發(fā)生集體砷中毒事件、四川省涼山州西昌市安寧鎮(zhèn)飲用水井砷污染事件、貴州省獨山縣瑞豐礦業(yè)公司違法排污造成砷污染事件、湖南省懷化市辰溪縣一家硫酸廠違法排污造成村民砷中毒事件、廣西河池市砷污染事件、河南省大沙河兩起砷污染事件、蘇魯交界邳蒼分洪道兩起砷污染重大突發(fā)環(huán)境事件等）。因此，引起了人們的高度重視。在土壤、水、礦物、植物中都能檢測出微量的砷。在正常人體組織中也含有微量的砷。[0003]隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，大量含砷化工廠建立，砷及其化合物被廣泛應(yīng)用于冶金以及各種除草劑、農(nóng)藥、化肥、殺菌劑的使用，在水體和土壤中的含量逐年增加，繼而在一些植物或動物體內(nèi)積累（如砷污染區(qū)的大米、貝殼類海鮮、動物肝腎臟等），并通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積，為目前已知的最易在體內(nèi)蓄積的毒物之一。砷對人體毒性很大，對腎、肺、肝、生殖、腦、皮膚、呼吸、腸道及血液系統(tǒng)均可產(chǎn)生毒性，砷在體內(nèi)的生化功能還未確定，但研宄提示砷可能在某些酶反應(yīng)中起作用，以砷酸鹽替代磷酸鹽作為酶的激活劑，以亞砷酸鹽的形式與巰基反應(yīng)作為酶抑制劑，從而可明顯影響某些酶的活性。有人觀察到，在做血透析的患者其血砷含量減少，并可能與患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、血管疾病有關(guān)。砷對環(huán)境的污染，主要是由工業(yè)廢水排放引起（我國規(guī)定工業(yè)廢水中砷的最高排放濃度為〇.Img·Γ1)。因此，對環(huán)境水體中類金屬砷的檢測顯得尤為必要。[0004]目前監(jiān)測和檢測金屬污染物主要有兩種方法：（1)物理化學(xué)分析法，如電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS)氣體氫化原子吸收光潛法（gaseoushydrideatomicabsorptionspectrometry，HGAAS)等，在文獻BelkinS.Microbialwhole-cellsensingsystemsofenvironmentalpollutants.CurrentOpinioninMicrobiology2003Jun;6(3):206-12中。其優(yōu)點是具備高檢測靈敏度和高特異性，但也存在一些不足，如儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，檢測周期長，最重要的一點是，傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法主要是對環(huán)境重金屬總量進行測定，不能檢測重金屬的生物可利用度；而化學(xué)顯色法、電化學(xué)法等，靈敏度、選擇性不高，不易準(zhǔn)確定量，特別是針對水體中生物有效性（bioavailability)重金屬的檢測，可選的特異、敏感、快速和便攜的檢測方法更少，難以對水體中重金屬生物毒性效應(yīng)進行客觀評價。（2)基于生物有機體的微生物法，其一般分為基于質(zhì)粒和基于基因組整合型兩種。質(zhì)粒整合型具有成本低、特異性強、快速、易操作等優(yōu)點，但是基于質(zhì)粒載體的生物檢測菌株存在細菌傳代后質(zhì)?？截悢?shù)不均一（數(shù)量過高或丟失）而導(dǎo)致檢測信號不穩(wěn)定、熒光本底值高和獨立實驗重復(fù)性不好等缺陷。利用模式生物大腸埃希氏菌（Escherichiacoli，E.coli)對特定化學(xué)物質(zhì)分子反應(yīng)的生物檢測技術(shù)克服了如上不足，因此，建立一種特異、敏感、快速、廉價、穩(wěn)定及精確的生物檢測技術(shù)及其產(chǎn)品來評價環(huán)境中砷的生物毒性大小已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。在一系列新的檢測方法中，生物監(jiān)測方法，特別是利用微生物全細胞傳感器來檢測污染物已成為國際環(huán)境科學(xué)研宄的熱點之〇[0005]生物檢測技術(shù)的基本原理即是利用模式生物對特定化學(xué)物質(zhì)的分子反應(yīng)機理。對于生物檢測技術(shù)而言需要三種必需的元件：針對特定或具有相似性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)的感應(yīng)器；由感應(yīng)器控制的啟動子；受此啟動子控制的報告基因。在設(shè)計生物檢測技術(shù)時，由于細菌具有在環(huán)境中大量存在、生長快速、低成本及易維護等優(yōu)點而受到研宄人員普遍親睞。在過去的研宄中利用生物檢測法來檢測環(huán)境中的特定污染物已經(jīng)引起了極大的關(guān)注，至今已經(jīng)研發(fā)了一系列針對特定有機物和無機化合物的生物檢測菌株及其產(chǎn)品，如：重金屬、甲苯及其衍生物等。[0006]目前對砷在大腸埃希氏菌的具體耐受機制已有大量研宄，對砷離子測定的生物檢測技術(shù)也有所研發(fā)，大腸埃希氏菌具有精細的調(diào)控系統(tǒng)使得細胞內(nèi)砷離子保持在較低的水平，有研宄已發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌中有兩種負責(zé)編碼將砷離子泵出基因，一種是存在于質(zhì)粒上的arsA基因和arsB基因共同作用形成膜離子通道蛋白將砷泵出來維持細胞體內(nèi)平衡，另一種是存在于基因組上的不含arsA基因而只含arsB基因形成膜離子通道蛋白將砷泵出來維持細胞體內(nèi)平衡。查閱文獻，研宄人員嘗試在DH5a大腸埃希氏菌基礎(chǔ)上構(gòu)建檢測砷離子的模式生物。但砷是一種常見的劇毒性環(huán)境污染類金屬，大部分細菌對砷具有耐受性以及抗性，故其敏感性不高。且這些研宄是基于質(zhì)粒作為表達載體，然而基于質(zhì)粒載體的生物檢測元件存在本底值高，細菌傳代后質(zhì)粒拷貝數(shù)不均一（數(shù)量過高或丟失），導(dǎo)致檢測信號不穩(wěn)定等缺陷。其作為檢測砷的宿主菌會造成檢測的不穩(wěn)定和最低檢測限偏高，這些非常不利于污染物的檢測，必須采用新的方法提高生物學(xué)檢測方法檢測砷離子的敏感性，以有效解決當(dāng)前環(huán)境監(jiān)測工作中遇到的瓶頸問題。JudithStocker在DevelopmentofaSetofSimpleBacterialBiosensorsforQuantitativeandRapidMeasurementsofArseniteandArsenateinPotableWaterEnvironsciTechnol.20030ct15；37(20)：4743-50.中等構(gòu)建的基于質(zhì)粒上的大腸埃希氏菌生物傳感器，其構(gòu)建策略是將大腸埃希氏菌質(zhì)粒上arsR啟動子arsR基因與luxCDABE基因或熒光蛋白基因或螢火蟲熒光素酶基因進行基因融合，再連接到pET28b質(zhì)粒載體上。其能被砷誘導(dǎo)發(fā)光，且是在野生大腸埃希氏菌基礎(chǔ)上構(gòu)建檢測砷離子的模式生物，存在熒光不穩(wěn)定性、本低值高等缺陷。在專利《一種檢測砷生物可利用度的微生物細胞傳感器》CN102796693A中，大腸埃希氏菌E.coli作為宿主細胞承載重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒為含有砷抗性系統(tǒng)ars啟動子、砷抗性系統(tǒng)調(diào)控基因arsR、焚光素酶基因Iuc和rrnb終止子串聯(lián)序列的pUC18質(zhì)粒。同樣是基于質(zhì)粒的微生物傳感器，存在上述基于質(zhì)粒作為表達載體的多種缺陷。重金屬微生物檢測技術(shù)的應(yīng)用受到限制而發(fā)展緩慢。【
發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明的目的：1.采用基因工程技術(shù)構(gòu)建一株熒光本底值低、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定、快速和成本低及定量檢測水體中類金屬砷濃度的大腸埃希氏菌生物檢測菌株；2.建立一種檢測水體中類金屬砷的微生物學(xué)方法。【
發(fā)明內(nèi)容】[0008]之一：提供一株檢測水體中類金屬砷的大腸埃希氏菌生物檢測菌株。[0009]本發(fā)明的大腸埃希氏菌是：大腸埃希氏菌（Escherichiacoli)WMC-OllpCGMCCNo.9760〇[0010]本發(fā)明的大腸埃希氏菌WMC-〇llp，已于2014年10月13日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，郵編100101)保藏，分類命名為大腸埃希氏菌（E.coli)，保藏編號為CGMCCNo.9760。[0011]本發(fā)明所述生物檢測菌株E.coliWMC-OllpCGMCCNo.9760的構(gòu)建方法是：[0012]1.基因敲除野生型大腸埃希氏菌E.coliMC4100基因組中arsB基因[0013]采用Red重組系統(tǒng)，敲除野生型大腸埃希氏菌E.coliMC4100基因組中砷離子"外排泵"基因arsB(序列如SEQIDNO.1所示）；[0014]2.構(gòu)建類金屬砷檢測元件pars-arsR_gfpmut2融合基因[0015]將大腸埃希氏菌基因組砷離子調(diào)芐基因arsR(序列如SEQIDNO.2所示）、啟動子ars(序列如SEQIDNO.3所示）以及熒光報告基因gfpmut2(序列如SEQIDNO.4所示）通過通過交叉PCR技術(shù)，構(gòu)建對類金屬砷離子特異反應(yīng)的檢測元件：pars-arsR-gfpmut2融合基因；[0016]3.采用基因敲入技術(shù)構(gòu)建檢測類金屬砷的大腸埃希氏菌生物檢測菌株[0017]采用基因敲入技術(shù)將含有增強型綠色焚光蛋白報告基因pars-arsR_gfpmut2置換到E.coliAarsB菌株基因組中araB(序列如SEQIDNO.5所示）基因編碼框位置。具體方法為：通過交叉PCR技術(shù)，形成含有pars-arsR-gfpmut2和araB基因兩側(cè)同源臂的融合片段，該DNA融合片段大小約為2.3kb，然后用無縫克隆的方法連接到pKOV條件復(fù)制質(zhì)粒，構(gòu)建pars-arsR-gfpmut2打祀載體，并將該打革E載體轉(zhuǎn)化到E.coliAarsB菌株中，通過溫度及蔗糖的選擇，挑選成功發(fā)生兩次同源重組的菌株，并進一步通過菌落PCR及測序鑒定篩選目的菌株。[0018]檢測原理：[0019]本發(fā)明所述大腸埃希氏菌菌株定量檢測水體中砷離子是采用pars啟動子直接啟動gfpmut2基因表達模式。在此構(gòu)建中，當(dāng)未添加外源性砷離子時，E.coliWMC-Ollp基因組中arsR基因編碼產(chǎn)生的ArsR蛋白結(jié)合于pars啟動子序列區(qū)，阻止GFPmut2表達；當(dāng)外源性砷離子進入大腸埃希氏菌胞內(nèi)后，As3+與ArsR蛋白結(jié)合，使ArsR蛋白從啟動子上脫落，激活E.coliWMC-Ollp基因組中pars-arsR-gfpmut2融合基因的表達，從而產(chǎn)生GFPmut2蛋白，并且產(chǎn)生的GFPmut2蛋白的量或其熒光強度與砷離子濃度呈劑量依賴關(guān)系，所以通過測定熒光強度可以達到定量檢測砷離子濃度的目的?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0020]之二：提供一種檢測水體中類金屬砷的微生物學(xué)方法[0021]本發(fā)明所述大腸埃希氏菌菌株檢測水體中類金屬砷的微生物學(xué)方法流程為：[0022]1.環(huán)境水體樣品測定的準(zhǔn)備：[0023]取10-50ml待測環(huán)境水體樣品，12OOOg離心5min，取上清，用0.5M稀鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)上清樣品的pH值為4-8,再用0.22微米的無菌針頭濾器過濾，過濾后樣品用于后續(xù)的測定。[0024]2.當(dāng)前第1頁1 2 3 4 5