貽貝蛋白降壓肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種貽貝蛋白降壓肽。
【背景技術(shù)】
[0002]血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)又稱為肽基-羧基肽酶或者激肽酶II，分子量為150，000Da，屬血管內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)合酶。ACE可以將十肽的血管緊張素I水解成八肽的血管緊張素II，促使血管進(jìn)一步收縮，導(dǎo)致血壓升高。同時(shí)，ACE也可通過作用于腎上腺皮質(zhì)而促進(jìn)醛固酮的分泌。因此，ACE是腎素-血管緊張素-醛固酮(RAS)的重要成分。另外，ACE還可以催化具有降壓作用的緩激肽水解而使其失去活性。因此，尋找合適的抑制體內(nèi)ACE活性的物質(zhì)，就可以達(dá)到降低或者控制血壓的目的。
[0003]血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)是一類發(fā)展迅速的抗高血壓藥物，其主要通過抑制ACE活性，致使血管緊張素I不能轉(zhuǎn)換為血管緊張素II，同時(shí)抑制ACE對緩激肽的滅活作用，從而產(chǎn)生降壓效應(yīng)。臨床上常用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)多為化學(xué)藥物，如卡托普利(Captopril)、阿拉普利(Alacepril)、賴諾普利(Lisinopril)和福辛普利(Fosinopril)等。但是，此類化學(xué)合成藥物臨床應(yīng)用過程中出現(xiàn)較多副作用，如粒細(xì)胞減少、咳嗽、皮瘆、發(fā)熱和味覺異常等，給患者帶來一定痛苦。
[0004]目前，ACE抑制活性肽(ACEP)由于其顯著的生理活性受到廣泛關(guān)注，與化學(xué)合成的ACEI相比較，ACEP的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在:(I)采用食用級蛋白酶水解制備獲得，安全性高，毒副作用小，多種ACEP動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床檢驗(yàn)結(jié)果，未觀察到明顯毒副作用；(2)食用蛋白原料來源廣，酶解制備條件溫和，易于產(chǎn)業(yè)化；(3) ACEP降壓效果專一，分子量低更易于消化吸收。因此，研宄和開發(fā)出具有降血壓作用的活性肽食品或藥物，成為水產(chǎn)品高效利用的一條重要途徑。
[0005]近年來，磁性微球作為固定化酶載體的研宄引起了廣泛重視。而采用“乳化復(fù)合技術(shù)”對瓊脂糖進(jìn)行改性，制備的瓊脂糖磁性微球具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):(I)具有磁性，在磁場作用下可迅速進(jìn)行分離；(2)生物相容性好；(3)表面含有大量功能基團(tuán)，吸附能力強(qiáng)；(4)分散性和穩(wěn)定性好。采用瓊脂糖磁性微球做載體，制備的磁性微球固定化ACE，在溶液中可與ACEP特異性吸附，在磁場作用下又可以迅速的與酶解液分離。但是，研宄者發(fā)現(xiàn)目前尚未有利用該技術(shù)從貽貝酶解物中制備降壓肽的研宄。
[0006]基于此，本發(fā)明采用酶解技術(shù)降解貽貝蛋白，利用超濾、磁性微球固定化ACE吸附和高效液相色譜技術(shù)制備降壓肽，為貽貝的高值化利用提供一條新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀提供一種對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)具有顯著的抑制作用的貽貝蛋白降壓肽。
[0008]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種貽貝蛋白降壓肽，該降壓肽的氨基酸序列為Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp (VSffPCRff), ES1-MS測定分子量為935.07 Da0
[0009]該貽貝蛋白降壓肽的快速制備方法為:
I)瓊脂糖磁性微球的制備與活化:按照重量體積比I ~ 1.5g: 30 mL將瓊脂糖加入到水中，共同煮沸至瓊脂糖完全溶解，加入I ml Fe3O4磁流體，在旋渦混合器上充分混合；在攪拌下將混合液滴入到80°C的有機(jī)相(Span-80:液體石蠟=Ig: 25mL)中，并在80°C下反應(yīng)15 ~ 20 min ;有機(jī)相冷卻至40°C后于250 rpm轉(zhuǎn)速機(jī)械攪拌10 ~ 15 min使微球成形，并在磁場中分離，制得的微球分別用石油醚和去離子水清洗3次，以清除殘余有機(jī)相，得瓊脂糖磁性微球；將他8比按照重量體積比2 ~ 3mg:1mL加入到NaOH溶液(0.8 -1.0 mol/L)中，然后將環(huán)氧氯丙烷按照體積比0.5 ~ 0.7:1再加入到NaOH溶液(0.8 -1.0 mol/L)中，最后按照重量體積比2 ~ 3 g:1 mL將瓊脂糖磁性微球加入到NaOH溶液(0.8 -1.0mol/L)中，于40°C下攪拌3~5 h，得活化瓊脂糖磁性微球。
[0010]) ACE的固定:按照質(zhì)量比I ~ 1.5: 10將血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和活化的瓊脂糖磁性微球加入硼酸鹽緩沖液(0.1 mol/L)中，40~50°C振蕩2~ 3 h后，混合液放入磁場中，將瓊脂糖磁性微球分離出來，并用蒸餾水充分洗滌，直至無酶蛋白被洗出，真空冷凍干燥得瓊脂糖磁性微球固定化ACE。
[0011])貽貝蛋白的酶解和超濾:將貽貝去殼，貽貝肉與甘氨酸-NaOH緩沖液按照Ig:3~ 5mL的重量體積比混合、勻漿，調(diào)節(jié)pH值至9.5 ~ 10，得混合液；混合液調(diào)溫度至45 ~55°C，按照貽貝肉質(zhì)量的0.5 ~ 0.8%加入堿性蛋白酶(2.0XlO5 U/g)，酶解4 ~ 6 h ;酶解液升溫至90~95°C，并于此溫度保持10 ~ 15min后；調(diào)溫度至35 ~ 40°C，用I mol/LNaOH溶液調(diào)pH至8.5~ 9.0，按照貽貝肉質(zhì)量的0.8 ~ 1.0%加入胰蛋白酶(1.9X 14 U/g)，酶解4-6 h后，將酶解液采用I kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，凍干，即為超濾酶解物。
[0012])貽貝蛋白降壓肽的制備:將超濾酶解物依次經(jīng)瓊脂糖磁性微球固定化ACE吸附和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得降壓肽。
[0013]作為優(yōu)選，所述步驟3)中的貽貝為厚殼貽貝diiViAs coruscus)ο
[0014]作為改進(jìn)，所述步驟4)中的瓊脂糖磁性微球固定化ACE吸附和RP-HPLC純化為: 瓊脂糖磁性微球固定化ACE的吸附:向硼酸鹽緩沖液(0.1 mol/L, pH 7.8)加入NaCl
至濃度為0.2 mol/L，然后加入超濾酶解物至濃度為5 ~ 8 mg/mL，最后按照溶液中酶解物重量的30 ~ 50倍加入瓊脂糖磁性微球固定化ACE，吸附45 min后，利用磁場將磁性微球與溶液分離，用硼酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌微球至洗滌液220 nm和280 nm無紫外吸收后，將磁性微球在1.0 mol/L的NaCl溶液中解吸附，利用磁場將磁性微球與溶液分離，溶液凍干，得降壓肽混合物。
[0015]RP-HPLC純化:將降壓肽混合物配成45 ~ 55 μ g/mL溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)對ACE的抑制活性的得降壓肽Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp (VSffPCRDo
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