一種用于乳腺癌診斷和預(yù)后判斷的免疫組化試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是EHD2的表達(dá)與亞細(xì)胞定位與乳腺癌患者的生 存具有顯著相關(guān)性，可以作為乳腺癌惡性度診斷和預(yù)后預(yù)判的一個分子指標(biāo)。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性常見惡性腫瘤。全世界每年有一百萬婦女患病，自20世紀(jì)70年代 末開始、我國乳腺癌的發(fā)病率一直居女性腫瘤的首位。北美、北歐原是乳腺癌的高發(fā)區(qū)，現(xiàn) 在我國的發(fā)病率也從五年前的十萬分之十七增加到去年的十萬分之五十二，呈快速上升趨 勢，而且發(fā)病年齡也越來越年輕化，年齡最小的只有十四歲。引發(fā)乳腺癌的因素是多方面 的，除遺傳因素外還有環(huán)境因素、精神因素及工作壓力太大等因素。而且經(jīng)濟(jì)越發(fā)達(dá)的城市 發(fā)病率越高于農(nóng)村。目前世界各國投入較大的精力和物力來研究該病的發(fā)生、發(fā)展，以便采 取積極的預(yù)防措施。
[0003] 目前在臨床上對腫瘤的惡性度判別主要還是基于在組織病理水平對腫瘤組織和 腫瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察，它對癌細(xì)胞的分化程度和侵犯特性有較強(qiáng)的辨別能力，準(zhǔn) 確率可達(dá)50%_75%。然而，這種基于形態(tài)學(xué)的解讀一方面受病理醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)等人為因素影響， 另一方面缺乏更深層次的與病人個體發(fā)病因素相關(guān)的分子依據(jù)，因此亟需與現(xiàn)代分子技術(shù) 相結(jié)合，才能提高判斷的準(zhǔn)確性和特異性，特別是為個體化治療路徑與方案的選擇提供理 論依據(jù)。
[0004] 雖然腫瘤的發(fā)生與多種因素相關(guān)，但最終的根源主要來自于基因水平的異常變 化，包括基因的擴(kuò)增、突變、缺失、異位等等，導(dǎo)致維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)所需的多個功能蛋 白在表達(dá)水平的高低、生化活性的強(qiáng)弱、甚至亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分布等方面產(chǎn)生變化，當(dāng)這種變化 賦予了細(xì)胞無限增殖能力及轉(zhuǎn)移能力，并不能被體內(nèi)外保護(hù)機(jī)制逆轉(zhuǎn)或殺滅時，便產(chǎn)生了 腫瘤。因此，對腫瘤惡性本質(zhì)的深刻認(rèn)識和有效控制的前提是明確這些功能蛋白分子的異 變情況，這需要借助免疫組織化學(xué)的手段。
[0005] 免疫組織化學(xué)技術(shù)應(yīng)用免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)基本原理，通過抗體對體內(nèi)蛋白質(zhì)分 子抗原的特異性識別，以及化學(xué)標(biāo)記（熒光素、酶、金屬離子、同位素等）的第二抗體的顯色 等作用來檢測組織細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)抗原（多肽和蛋白質(zhì)）的表達(dá)量及其亞細(xì)胞定位。近年來， 隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的成功研發(fā)，更主要的是對腫瘤分子機(jī)制 認(rèn)識的不斷深入，免疫組化在腫瘤診斷與鑒別中的應(yīng)用價值受到了普遍的認(rèn)可。比如雌激 素受體ER、孕激素受體PR和表皮生長因子受體家族的Her2已經(jīng)被廣泛用于乳腺癌的臨床 分子病理診斷，它對乳腺癌的病理分類和臨床用藥起到了積極的指導(dǎo)作用。這些成果離不 開腫瘤基礎(chǔ)研究的進(jìn)步，并期待新的分子指標(biāo)被進(jìn)一步揭不和納入臨床應(yīng)用，不斷提1?腫 瘤診治水平。EHD2基因及其編碼蛋白即可能是這種新的分子指標(biāo)。
[0006] EHD2(Epsin homology(EH)-domain-containing proteins)屬于EHD蛋白的一種， 是一類新型膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白，含有高度保守的EH結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域是一個含有約一百個 氨基酸殘基的片段，早先發(fā)現(xiàn)于EGFR的激酶底物Epsl5 (Epdemal Growth Factor Receptor PathwaySubstrate Clonel5)。EHD2參與胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的各步調(diào)控，包括內(nèi)轉(zhuǎn)及前、后內(nèi)含體的 過渡和調(diào)控循環(huán)通路；膜及膜蛋白的各路調(diào)節(jié)，包括消化降解及循環(huán)再生。是整個胞膜轉(zhuǎn)運(yùn) 機(jī)制的必不可少的重要環(huán)節(jié)，對在各種細(xì)胞活動中維護(hù)物料傳輸信號傳導(dǎo)的動態(tài)平衡起著 關(guān)鍵的作用，它的失調(diào)將導(dǎo)致信號應(yīng)答失當(dāng)，細(xì)胞功能紊亂，并可能進(jìn)而引發(fā)疾病。
[0007] 中國文獻(xiàn)"EHD2干擾影響永生化乳腺上皮細(xì)胞的增殖和遷移"（王洪玉等，中國腫 瘤臨床，2011年第38卷第11期，）公開了在乳腺腫瘤中EHD2的基因表達(dá)失調(diào)下降，提示該 基因可能是一個新的乳腺抑癌基因。然而在進(jìn)一步免疫組化研究中我們發(fā)現(xiàn)，雖然EHD2在 總體表達(dá)量上呈現(xiàn)下降的趨勢，但這種趨勢主要在核中；相反，細(xì)胞漿中的表達(dá)卻有升高的 趨勢。而且，EHD2在核中的表達(dá)水平與患者的生存情況密切相關(guān)。因此對EHD2進(jìn)行免疫 組化檢測將更客觀準(zhǔn)確地反映腫瘤的異化本質(zhì)和患者個體的臨床預(yù)后情況。
[0008] 現(xiàn)有的商業(yè)化EHD2抗體有十余種，由主流抗體試劑公司Santa Cruz和Abcam等 提供，但是均屬于基礎(chǔ)研究用試劑，沒有依據(jù)表明這些抗體可以和我們的抗體一樣具有合 格的特異性并可用于免疫組化檢測，特別是目前尚沒有任何其它EHD2抗體經(jīng)過大量組織 標(biāo)本的免疫組化驗(yàn)證并顯示出可以通過對EHD2的亞細(xì)胞異常定位檢測來達(dá)到對腫瘤的惡 性度及患者生存情況進(jìn)行預(yù)后預(yù)判的目的。與本專利申請抗體相比它們有如下缺陷：
[0009] 1、根據(jù)本領(lǐng)域公知常識，能夠用于免疫組化（IHC)的抗體會在其使用說明中作 出明確標(biāo)識和注明，按這些抗體的說明所示，大多數(shù)都不能用于免疫組化（IHC)檢測。雖 然個別抗體標(biāo)明可用于免疫組化（IHC)，但仔細(xì)研究發(fā)現(xiàn)并非如此。一個是南京森貝伽公 司代理的EHD2抗體，但是注明了只能檢測膜定位。另一個是Proteintech公司的貨號為 11440-1-AP的抗體，然而此抗體的特異性存在問題：首先免疫印跡檢測得到的主要信號位 置明顯小于60kD，而70kD的正常位置信號卻很弱，說明雖然可以檢測到EHD2,但更多檢測 到的是其它未知分子；其次從公司發(fā)表的該抗體對肺癌組織的免疫組化圖中可見染色信號 為明顯的基質(zhì)成分的非特異性著色。
[0010] 2、這些抗體均為研究用試劑，沒有經(jīng)過大樣本臨床病例試驗(yàn)或驗(yàn)證，沒有關(guān)鍵的 對EHD2的核定位檢測能力，因此也就沒有"通過對EHD2的亞細(xì)胞異常定位檢測來達(dá)到對腫 瘤的惡性度及患者生存情況進(jìn)行預(yù)后預(yù)判的目的"的前提條件與基礎(chǔ)。
[0011] 3、均沒有經(jīng)過嚴(yán)格的免疫印跡特異性驗(yàn)證，特別是與EHD2蛋白的同源蛋白EHD1、 EHD3、EHD4的交叉反應(yīng)的免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，而這些驗(yàn)證對EHD2的免疫組化檢測方法來說 尤其重要，因?yàn)樗鼈冎g具有很高的同源性（>70%)。
[0012] 中國文獻(xiàn)"EHD2下調(diào)促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究"(田剛等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志， 2012年第27卷第1期，49-51)公開了一種由其自制的EHD2抗體，這一抗體是采用我們的 沒有經(jīng)過抗原純化的抗體，可以用于免疫印跡檢測，但不能滿足免疫組化檢測的高度特異 性要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 我們在免疫組化研究中發(fā)現(xiàn)，正常上皮細(xì)胞中EHD2主要分布在細(xì)胞核，同時細(xì)胞 漿與膜中也有少量表達(dá)。但在乳腺癌組織中，EHD2的定位發(fā)生異變，核分布顯著下降，漿 與膜分布卻出現(xiàn)升高的趨勢。臨床因素分析結(jié)果表明，EHD2的核分布情況與患者預(yù)后緊密 相關(guān)，核表達(dá)越弱則患者的生存情況越差。這些發(fā)現(xiàn)表明乳腺癌的惡性度與癌組織細(xì)胞中 EHD2蛋白的表達(dá)位置和表達(dá)水平發(fā)生異變的程度密切關(guān)聯(lián)，而免疫組化技術(shù)是檢測這種表 達(dá)紊亂程度的唯一可靠手段。因此提供一種檢測EHD2基因的表達(dá)產(chǎn)物在癌細(xì)胞內(nèi)部不同 位置特別是核中的表達(dá)情況的方法為現(xiàn)有技術(shù)中需要解決的問題。
[0014] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)手段和方案：
[0015] 一種對人EHD2蛋白特異的抗體，其特征是所述抗體能特異性識別人EHD2蛋白，所 述識別位點(diǎn)的氨基酸序列為：503-SEQ ID N0:l-543。
[0016] 基因 EHD2及其編碼蛋白在乳腺癌免疫組織化學(xué)法診斷和預(yù)后預(yù)判中的應(yīng)用，所 述基因 EHD2的GeneBank國際通用序列編號為：NM_014601，所述基因 EHD2編碼蛋白的 GeneBank國際通用序列編號為：NP_055416。
[0017] 所述基因 EHD2及其編碼蛋白在乳腺癌免疫組織化學(xué)法診斷和預(yù)后預(yù)判中的應(yīng) 用，其特征是采用了前述抗體。
[0018] 基因 EHD2及其編碼蛋白在制備乳腺癌免疫組織化學(xué)法診斷和預(yù)后預(yù)判試劑中的 應(yīng)用，所述基因 EHD2的GeneBank國際通用序列編號為：NM_014601。
[0019] 所述基因 EHD2及其編碼蛋白在制備乳腺癌免疫組織化學(xué)法診斷和預(yù)后預(yù)判試劑 中的應(yīng)用，其特征是采用了前述抗體。
[0020] 一種多肽，其特征是所述多肽氨基酸序列為SEQ ID NO :1，。
[0021] 所述多肽，優(yōu)選以前述多肽氨基酸序列為核心序列對其進(jìn)行修飾，所述修飾為在 多肽N端連接一個半胱氨酸。
[0022] 所述多肽在制備前述抗體中的應(yīng)用。所述應(yīng)用優(yōu)選為作為抗原對動物進(jìn)行免疫以 制備EHD2抗體。
[0023] 所述多肽在制備對EHD2特異的抗體中的應(yīng)用。所述應(yīng)用優(yōu)選為對抗體進(jìn)行抗原 純化。
[0024] -種用于乳腺癌診斷和預(yù)后判斷免疫組化試劑，其特征是采用前述對人EHD2蛋 白特異的抗體作為一抗或核心抗體。
[0025] 本發(fā)明說明書中所采用的術(shù)語：
[0026] "基因 EHD2的編碼蛋白"即"EHD2蛋白"。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，當(dāng)說明書中 提及"EHD2的表達(dá)"時，即是指"基因 EHD2及其編碼蛋白的表達(dá)"。
[0027] "核心序列"為人EHD2蛋白（genebank蛋白號NP_055416)的第503至543位氨基 酸序列，該核心序列對應(yīng)的多肽片段在化學(xué)合成后或重組表達(dá)后經(jīng)或不經(jīng)修飾可用于免疫 以產(chǎn)生對EHD2特異的抗體。
[0028] "修飾"為對上述核心序列對應(yīng)的多肽片段用化學(xué)方法或重組DNA等常規(guī)方法進(jìn)行 添加氨基酸、偶聯(lián)化學(xué)基團(tuán)或純化介質(zhì)