鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子印跡技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]瘦肉精是具有腎上腺素受體激動(dòng)作用的一類藥物的統(tǒng)稱，又稱β 2-興奮劑，具有促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)、提高瘦肉率的作用，曾作為生長(zhǎng)添加劑被廣泛關(guān)注，但β 2-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物體內(nèi)有一定的殘留時(shí)間，通過食物鏈進(jìn)入人體后會(huì)使一些易感人群產(chǎn)生明顯的中毒癥狀，危害人類健康。鹽酸克倫特羅(Clenbuterol，CLB)是瘦肉精中的一種，它能夠明顯促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，并增加瘦肉率，因而被一些不法分子使用在動(dòng)物生產(chǎn)中用來增加瘦肉率。研宄表明，殘留在動(dòng)物體內(nèi)的鹽酸克倫特羅被人使用后會(huì)毒害腎臟、肝臟等器官，會(huì)出現(xiàn)頭痛不適、惡心嘔吐、肌肉顫抖、心率加快、頭暈?zāi)垦５劝Y狀，甚至?xí)?dǎo)致死亡，因此，我國(guó)嚴(yán)禁在動(dòng)物生產(chǎn)中使用鹽酸克倫特羅?，F(xiàn)有檢測(cè)鹽酸克倫特羅的方法均需要復(fù)雜的樣品處理過程和分析步驟，需要大型儀器及經(jīng)過專門訓(xùn)練的專業(yè)人員操作，時(shí)間長(zhǎng)、成本高，遠(yuǎn)不能滿足在線檢測(cè)的要求。
[0003]試紙法由于具有攜帶方便、操作簡(jiǎn)單、測(cè)定速度快等特點(diǎn)，在食品、水質(zhì)、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域有較多應(yīng)用。如2001年河南省農(nóng)科院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與河南百奧生物工程有限公司于成功研發(fā)了“瘦肉精”專用快速檢測(cè)試紙技術(shù)并投放市場(chǎng)，使用該試紙可在60秒內(nèi)快速直觀地檢測(cè)出肉品中是否含有超過安全標(biāo)準(zhǔn)的“瘦肉精”，該試紙檢測(cè)技術(shù)以單克隆抗體為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)而成，檢測(cè)時(shí)膠體金標(biāo)記的“瘦肉精”單抗被檢測(cè)線上固定化的“瘦肉精”人工結(jié)合抗原捕獲，形成一條棕紅色的檢測(cè)線，過量的膠體金標(biāo)記單抗繼續(xù)涌動(dòng)被對(duì)照線上固定化的羊抗鼠抗體捕獲形成一條棕紅色的對(duì)照線，如果樣品中含有“瘦肉精”，它將與固定化在檢測(cè)線上的人工抗原競(jìng)爭(zhēng)有限的膠體金標(biāo)記單抗。申請(qǐng)?zhí)枮?00810219632.1的中國(guó)專利，公開了一種鹽酸克倫特羅檢測(cè)試紙及其檢測(cè)方法，該紙包括支撐固定粘襯層，在支撐固定粘襯層上依次有樣品吸附層、結(jié)合墊、微孔虹吸反應(yīng)層和吸水材料層，在結(jié)合墊上有示蹤粒子標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體和示蹤粒子標(biāo)記的抗體A，當(dāng)樣品中含有5納克以上的鹽酸克倫特羅時(shí)，檢測(cè)區(qū)出現(xiàn)兩條線，當(dāng)樣品中鹽酸克倫特羅含量小于5納克時(shí)，檢測(cè)區(qū)出現(xiàn)一條線，該試紙具有與夾心法等同的檢測(cè)模式及判讀方式且成本低，該檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快捷，操作簡(jiǎn)單。但上述方法在使用中存在以下問題:超過判讀時(shí)間容易出現(xiàn)假陰性、假陽性結(jié)果，質(zhì)控線有時(shí)不顯現(xiàn)，檢測(cè)線顏色模糊不清，漏檢率偏高等，因此，尋找一種快捷、方便、高選擇、高靈敏的檢測(cè)鹽酸克倫特羅的試紙方法具有重要意義。
[0004]分子印跡是近年來興起的分子特異性識(shí)別技術(shù)，具有對(duì)模板分子在功能基團(tuán)、分子尺寸、空間結(jié)構(gòu)具有記憶功能的結(jié)合位點(diǎn)，可以根據(jù)預(yù)定的選擇性和高度識(shí)別性能進(jìn)行分子識(shí)別，在印跡中形成的特異性識(shí)別位點(diǎn)能和被分析物選擇性作用，并且這種作用是可逆的，這種合成的材料機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性好，能在極端環(huán)境中使用?，F(xiàn)已有將分子印跡技術(shù)結(jié)合試紙法制備得到的分子印跡試紙條，不僅具備了分子印跡特異識(shí)別能力，且具有試紙條檢測(cè)速度快、攜帶方便的特點(diǎn)，但是目前尚未有鹽酸克倫特羅分子印跡試紙及其檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道，而制備分子印跡試紙的關(guān)鍵技術(shù)是制備適用于該檢測(cè)方法的鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有的經(jīng)典鹽酸克倫特羅的檢測(cè)方法前處理復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)、成本高，現(xiàn)有的試紙法易出現(xiàn)假陰性假陽性結(jié)果、漏檢率高等現(xiàn)狀，提供了一種鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物及其制備方法，該聚合物合成簡(jiǎn)單快捷、成本低、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好。本發(fā)明的鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物可結(jié)合試紙法制成試紙條，用于痕量在線檢測(cè)鹽酸克倫特羅。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0007]一種鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物，該聚合物以鹽酸克倫特羅為模板分子，以α -甲基丙烯酸為功能單體，以氫鍵形式進(jìn)行相互作用，加入交聯(lián)劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、引發(fā)劑過硫酸銨發(fā)生自由基共聚，得到鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物；
[0008]所述模板分子、功能單體、交聯(lián)劑的摩爾比為117-274:1-300:30-90。
[0009]以上所述的鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物，所述模板分子、功能單體、交聯(lián)劑的摩爾比優(yōu)選為9.78:1:3.03。
[0010]一種以上所述鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟:
[0011]1.配制濃度為3Χ 10_3-3X 10_5mol/L的鹽酸克倫特羅水溶液；
[0012]2.將3-7“1^-甲基丙烯酸加入到10-301^濃度為3\1(^-3\1011101/1鹽酸克倫特羅水溶液中，超聲處理5-15分鐘，再加入0.0014-0.0042g N，N-亞甲基雙丙烯酰胺，繼續(xù)超聲處理10-30分鐘，靜置過夜，得混合液；
[0013]3.將80-120 μ L濃度為0.5mol/L的過硫酸銨溶液，緩慢加入到步驟2得到的混合液中，超聲處理10-20分鐘，即得到鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物。
[0014]以上所述鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物的應(yīng)用，所述鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物可用于色譜分析、固相萃取或膜分離等領(lǐng)域。
[0015]以上所述鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物的應(yīng)用，所述色譜分析的具體方法為:將所述鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物用于制備分子印跡試紙條，結(jié)合酶放大效應(yīng)技術(shù)，快速定性及定量測(cè)定鹽酸克倫特羅。
[0016]利用化學(xué)法聚合制備得到鹽酸克倫特羅的分子印跡聚合物，將其制備成分子印跡試紙條，用25%乙醇洗脫模板分子鹽酸克倫特羅，留下對(duì)鹽酸克倫特羅具有特異性識(shí)別能力的印跡孔穴。印跡膜表面的孔穴能夠同時(shí)識(shí)別鹽酸克倫特羅及具有相同結(jié)構(gòu)的葡萄糖氧化酶標(biāo)記的鹽酸克倫特羅。將洗脫模板分子的試紙條在高濃度的葡萄糖氧化酶標(biāo)記的鹽酸克倫特羅中孵化后，印跡孔穴被葡萄糖氧化酶標(biāo)記的鹽酸克倫特羅占據(jù)。隨后競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)是在樣品中的鹽酸克倫特羅和印跡膜上的葡萄糖氧化酶標(biāo)記的鹽酸克倫特羅之間進(jìn)行，鹽酸克倫特羅能夠競(jìng)爭(zhēng)取代葡萄糖氧化酶標(biāo)記的鹽酸克倫特羅重新占據(jù)孔穴。隨著樣品中鹽酸克倫特羅分子濃度的增加，印跡膜上被競(jìng)爭(zhēng)取代的葡萄糖氧化酶標(biāo)記的鹽酸克倫特羅就越多，即殘留在印跡膜上的葡萄糖氧化酶就越少。而印跡膜表面的葡萄糖氧化酶能夠與底液中的葡萄糖發(fā)生酶解反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫進(jìn)一步氧化分解底液中的署紅Y使其褪色，因此，通過檢測(cè)試紙條的熒光強(qiáng)度，能對(duì)樣品中的鹽酸克倫特羅進(jìn)行快速定性、半定量或定量分析。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:
[0018]1.本發(fā)明鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物合成簡(jiǎn)單快捷、成本低、穩(wěn)定性好，電化學(xué)性能表征結(jié)果證明:該印跡聚合物對(duì)鹽酸克倫特羅具有特異識(shí)別性能，印跡效果好，識(shí)別效果理想。
[0019]2.本發(fā)明鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物可用于色譜分析、固相萃取、膜分離等領(lǐng)域，將所述鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物用于制備分子印跡試紙條，結(jié)合酶放大效應(yīng)技術(shù)，能快速定性及定量測(cè)定鹽酸克倫特羅，用于痕量在線檢測(cè)鹽酸克倫特羅。
【附圖說明】
[0020]圖1實(shí)施例1鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物印跡效果電化學(xué)性能分析圖。
[0021]圖2為本發(fā)明實(shí)施例5試紙條的熒光圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但不限制本發(fā)明的使用范圍和應(yīng)用范圍。
[0023]一、鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物的制備方法
[0024]實(shí)施例1
[0025]一種鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟:
[0026]1.配制濃度為3 X 10_4mol/L的鹽酸克倫特羅水溶液；
[0027]2.將5 μ L α -甲基丙烯酸加入到20mL濃度為3 X 10_4mol/L鹽酸克倫特羅水溶液中，超聲處理10分鐘，再加入0.0028g N，N-亞甲基雙丙烯酰胺，繼續(xù)超聲處理20分鐘，靜置過夜，得混合液(所述鹽酸克倫特羅、α -甲基丙烯酸、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺加入量的摩爾比為 9.78:1:3.03)；
[0028]3.將100 μ L濃度為0.5mol/L的過硫酸銨溶液，緩慢加入到步驟2得到的混合液中，超聲處理15分鐘引發(fā)聚合反應(yīng)，即得到鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物。
[0029]實(shí)施例2
[0030]一種鹽酸克倫特羅分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟:
[0031]1.配制濃度為3X 1