一種原代肝組織細(xì)胞分離系統(tǒng)及分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種原代肝組織細(xì)胞分離系統(tǒng)及分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]原代肝細(xì)胞是肝臟疾病基礎(chǔ)和臨床研宄的重要材料。特別是在臨床中，肝衰竭患者內(nèi)科保守治療效果不佳，而肝源和高昂經(jīng)費(fèi)讓肝移植治療難以惠及大多數(shù)病人。人工肝，尤其是生物人工肝是目前肝衰竭有希望的療法，但從肝組織中獲得大量原代肝細(xì)胞的方法尚不完善?，F(xiàn)有主流的分離方法是通過(guò)多種非專用的裝置(如蠕動(dòng)泵、金屬盆、水浴溫箱)對(duì)肝組織灌注含有膠原酶的細(xì)胞分離液，使得肝細(xì)胞從組織中分離出來(lái)。其操作過(guò)程繁復(fù)，操作條件要求無(wú)菌，操作器械多樣，對(duì)操作者有較高的技術(shù)要求。此外，由于缺乏有效的過(guò)濾裝置，即使膠原酶仍有活性，膠原酶也極少重復(fù)使用，因此操作過(guò)程消耗膠原酶較多，費(fèi)用高。因此，一種簡(jiǎn)便、高效、經(jīng)濟(jì)的肝臟組織細(xì)胞分離系統(tǒng)亟待開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、高效、自動(dòng)的原代肝組織細(xì)胞分離系統(tǒng)及分離方法，為滿足肝病基礎(chǔ)研宄和臨床實(shí)踐中生物型人工肝、原代肝細(xì)胞的需求，可以持續(xù)大量獲得原代肝細(xì)胞，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問(wèn)題。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
一種原代肝組織細(xì)胞分離系統(tǒng)，由控制面板、循環(huán)泵管路、細(xì)胞分離盒和細(xì)胞富集瓶組成，
所述控制面板上分別設(shè)有顯示屏以及控制儲(chǔ)液管中的磁力攪拌旋鈕、控制循泵旋鈕、水浴鍋溫度控制旋鈕、液壓監(jiān)測(cè)控制旋鈕；
所述循環(huán)泵管路包括儲(chǔ)液罐和滾壓式泵，儲(chǔ)液罐通過(guò)循環(huán)管路連接在滾壓式泵的進(jìn)口，滾壓式泵出口上連接的循環(huán)管路上安裝有液壓溫度監(jiān)測(cè)器，儲(chǔ)液罐內(nèi)放置有磁力攪拌轉(zhuǎn)子，儲(chǔ)液罐放置在內(nèi)恒溫水浴鍋，恒溫水浴鍋放置在磁力攪拌裝置上；
所述細(xì)胞分離盒的兩端分別設(shè)有第一螺旋接口和第二螺旋接口，第一螺旋接口與滾壓式泵出口的循環(huán)管路連接，細(xì)胞分離盒的內(nèi)部前端設(shè)有與第一螺旋接口連接的多項(xiàng)接頭，所述細(xì)胞分離盒內(nèi)設(shè)有孔徑依次減小的第一篩網(wǎng)、第二篩網(wǎng)和第三篩網(wǎng)，所述第一篩網(wǎng)與多項(xiàng)接頭之間設(shè)有組織灌注槽；
所述細(xì)胞富集瓶包括富集瓶體，富集瓶體頂端通過(guò)富集瓶導(dǎo)管接第二螺旋接口，富集瓶導(dǎo)管上安裝有富集瓶上開關(guān)，富集瓶體內(nèi)設(shè)有細(xì)胞篩，富集瓶體下端通過(guò)分離瓶下導(dǎo)管連接在儲(chǔ)液罐內(nèi)，分離瓶下導(dǎo)管上安裝有富集瓶下開關(guān)。
[0005]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述細(xì)胞分離盒的構(gòu)型為一個(gè)由窄至寬的立體梯形，且第一螺旋接口設(shè)置在細(xì)胞分離盒的窄端，第二螺旋接口設(shè)置在細(xì)胞分離盒的寬端。
[0006]作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案:所述第一篩網(wǎng)的孔徑為300目，第二篩網(wǎng)的孔徑為200目，第三篩網(wǎng)的孔徑為100目。
[0007]一種原代肝組織細(xì)胞分離系統(tǒng)的分離方法，具體步驟如下:
(1)通過(guò)控制面板掌控系統(tǒng)的運(yùn)行，保證工作環(huán)境的調(diào)控及監(jiān)測(cè)；
(2)將新鮮采集的無(wú)菌肝組織樣本放入細(xì)胞分離盒內(nèi)的組織灌注槽內(nèi)，若組織塊較大，則分割成小塊后放入多個(gè)細(xì)胞分離盒中，多個(gè)細(xì)胞分離盒并聯(lián)同時(shí)運(yùn)行；
(3)根據(jù)組織情況，把多項(xiàng)接頭連接上導(dǎo)管或者穿刺針，對(duì)肝組織樣本進(jìn)行門脈連接或者多點(diǎn)穿刺；
(4)在儲(chǔ)液罐中加入無(wú)菌生理鹽水，并調(diào)節(jié)控制面板上的溫度控制旋鈕調(diào)控儲(chǔ)液罐中生理鹽水的溫度至37°C，打開循環(huán)泵控制旋鈕控制滾壓式泵啟動(dòng)，使生理鹽水對(duì)肝組織進(jìn)行初步灌注清洗2min，排除腔隙中的血細(xì)胞以及雜質(zhì)；
(5)把第一篩網(wǎng)、第二篩網(wǎng)和第三篩網(wǎng)按順序插入細(xì)胞分離盒的相應(yīng)卡槽中，扣上盒蓋，并將儲(chǔ)液罐清洗干凈，置換無(wú)菌細(xì)胞分離液；
(6)再次打開磁力攪拌旋鈕、溫控控制旋鈕和循環(huán)泵控制旋鈕，儲(chǔ)液罐中的細(xì)胞分離液充分混勻，并加熱至37°C，隨循環(huán)泵管路進(jìn)入細(xì)胞分離盒，通過(guò)細(xì)胞分離盒前部的多項(xiàng)接頭，分別有三個(gè)導(dǎo)管或者穿刺針對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)灌注，細(xì)胞分離液與肝組織充分接觸同時(shí)伴有持續(xù)穩(wěn)定的灌注壓；
(7)分離下來(lái)的肝細(xì)胞及組織隨循環(huán)液依次流經(jīng)第一篩網(wǎng)、第二篩網(wǎng)和第三篩網(wǎng)，將單細(xì)胞懸液匯聚細(xì)胞富集瓶中，含有膠原酶的細(xì)胞分離液分離循環(huán)回儲(chǔ)液罐中；
(8)待肝組織細(xì)胞分離完畢，先關(guān)閉循環(huán)泵控制旋鈕，再關(guān)閉富集瓶上開關(guān)和富集瓶下開關(guān)，取下富集瓶體，完成原代細(xì)胞分離。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明系統(tǒng)將原代肝細(xì)胞分離過(guò)程集合在一整套系統(tǒng)中，保證整個(gè)分離過(guò)程的封閉無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行，同時(shí)使分離條件因素能被精確的控制，保證穩(wěn)定的灌注壓，多點(diǎn)灌注位置，循環(huán)利用含有膠原酶的灌注液；同時(shí)分離盒、富集瓶及管路系統(tǒng)可以作為一次性無(wú)菌耗材制備，降低成本，方便實(shí)用；本發(fā)明有助于為科學(xué)研宄及生物人工肝，提供大量?jī)?yōu)質(zhì)的原代肝細(xì)胞。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為原代肝組織細(xì)胞分離系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0010]圖2為原代肝組織細(xì)胞分離系統(tǒng)中細(xì)胞分離盒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖。
[0011]圖中:1_顯不屏；2_液壓監(jiān)測(cè)旋鈕；3_溫度控制旋鈕；4_循環(huán)栗控制旋鈕；5_磁力攪拌旋鈕；6_恒溫水浴鍋；7_磁力攪拌裝置；8_儲(chǔ)液罐；9_滾壓式泵泵；10-液壓溫度監(jiān)測(cè)器；11_循環(huán)管路；12_前旋入接口 ；13_多項(xiàng)接頭；14_組織灌注槽；15_第一網(wǎng)篩；16_第二網(wǎng)篩；17_第三網(wǎng)篩；18_后旋入接口 ；19_富集瓶導(dǎo)管；20_富集瓶上開關(guān)；21_富集瓶體；22_細(xì)胞篩；23_富集瓶下開關(guān)；24_分離瓶下導(dǎo)管；25_循環(huán)泵管路；26_控制面板；27-細(xì)胞富集瓶；28_細(xì)胞分離盒。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0013]請(qǐng)參閱圖1?2，本發(fā)明實(shí)施例中，一種原代肝組織細(xì)胞分離系統(tǒng)，由控制面板26、循環(huán)泵管路25、細(xì)胞分離盒28和細(xì)胞富集瓶27組成。
[0014]控制面板26上分別設(shè)有顯示屏I以及控制儲(chǔ)液管中的磁力攪拌旋鈕5、控制循泵旋鈕4、水浴鍋溫度控制旋鈕3、液壓監(jiān)測(cè)控制旋鈕2，顯示屏I實(shí)時(shí)顯示系統(tǒng)中的液壓、溫度及控制旋鈕的設(shè)定參數(shù)。
[0015]循環(huán)泵管路25包括儲(chǔ)液罐8和滾壓式泵9，滾壓式泵9是一個(gè)4cm正方形軸與
4.2cm直徑的圓周組成，其正方形四角擠壓通過(guò)圓周的管路形成泵壓；滾壓式泵9通過(guò)調(diào)節(jié)泵頭轉(zhuǎn)動(dòng)擠壓循環(huán)管路11驅(qū)動(dòng)儲(chǔ)液罐8中的含有膠原酶的細(xì)胞分離液循環(huán)流動(dòng)，并提供持續(xù)的肝組織灌注壓力；儲(chǔ)液罐8通過(guò)循環(huán)管路11連接在滾壓式泵9的進(jìn)口，循環(huán)管路11采用直徑為0.5cm的透明軟管，滾壓式泵9出口上連接的循環(huán)管路11上安裝有液壓溫度監(jiān)測(cè)器10，儲(chǔ)液罐8內(nèi)放置有磁力攪拌轉(zhuǎn)子7，儲(chǔ)液罐8放置在內(nèi)恒溫水浴鍋6，恒溫水浴鍋6放置在磁力攪拌裝置上，儲(chǔ)液罐中的磁力攪拌轉(zhuǎn)子7工作時(shí)保證循環(huán)使用的膠原酶濃度，同時(shí)也能使恒溫水浴鍋對(duì)含有膠原酶的細(xì)胞分離液均勻恒溫，使膠原酶發(fā)揮最佳效果。
[0016]在管路系統(tǒng)中的液壓溫度監(jiān)測(cè)器10，可以對(duì)系統(tǒng)運(yùn)行狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其中溫度監(jiān)測(cè)保證細(xì)胞分離液的最佳工作溫度；液壓監(jiān)測(cè)是明確管路通暢的重要指標(biāo)，并且指示篩網(wǎng)是否阻塞嚴(yán)重，可暫停運(yùn)行，置換篩網(wǎng)，繼續(xù)工作。
[0017]細(xì)胞分離盒28的構(gòu)型為一個(gè)由窄至寬的立體梯形，封閉無(wú)菌，運(yùn)行過(guò)程避免環(huán)境的干擾，上底為3cm，下底為9cm，縱軸長(zhǎng)11cm，細(xì)胞分離盒28的兩端分別設(shè)有第一螺旋接口12和第二螺旋接口 18，且第一螺旋接口 12設(shè)置在細(xì)胞分離盒28的窄端，第二螺旋接口 18設(shè)置在細(xì)胞分離盒28的寬端。
[0018]第一螺旋接口 12與滾壓式泵9出口的循環(huán)管路11連接，細(xì)胞分離盒28的內(nèi)部前端設(shè)有與第一螺旋接口 12連接的多項(xiàng)接頭13，多項(xiàng)接頭13可以根據(jù)不同組織需求連接不同數(shù)量的導(dǎo)管或者穿刺針，進(jìn)行多點(diǎn)穿刺灌注，有利于細(xì)胞分離液在組織中充分浸潤(rùn)，發(fā)揮作用。
[0019]細(xì)胞分離盒28內(nèi)設(shè)有孔徑依次減小的第一篩網(wǎng)15、第二篩網(wǎng)16和第三篩網(wǎng)17，第一篩網(wǎng)15的孔徑為300目，第一篩網(wǎng)15主要目的是阻截