一種純化螢火蟲熒光素酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種純化螢火蟲熒光素酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 熒光素酶是生物體內(nèi)催化熒光素或者脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱，可以從細(xì) 菌、螢火蟲等生物中提取出來。螢火蟲熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)必須要ATP和螢火蟲熒光 素的參與。熒光素酶可以分為螢火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶兩大類。由于熒光素酶檢測(cè) 簡(jiǎn)便、靈敏、快速，因此目前熒光素酶基因在基因工程領(lǐng)域已經(jīng)成為廣泛使用的報(bào)告基因。 其內(nèi)源性低，檢測(cè)不易受到干擾，靈敏度高，檢測(cè)范圍廣。螢火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶 可分別從螢火蟲和發(fā)光細(xì)菌中直接提取，亦可用基因工程的方法進(jìn)行生產(chǎn)。熒光素酶催化 的發(fā)光反應(yīng)能用生物發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行靈敏、快速檢測(cè)，因此該酶有多方面的用途，如應(yīng)用于 快速檢測(cè)、報(bào)告基因分析、有毒有害物質(zhì)分析等。
[0003] 熒光素酶發(fā)出的光的顏色主要取決于熒光素周圍的氨基酸。在正常情況下它發(fā)出 黃綠光。但如果將其中的絲氨酸變?yōu)樘於彼?蛋白質(zhì)編號(hào)2dlt)，則它會(huì)發(fā)出紅光。
[0004] 熒光生成反應(yīng)通常分為以下兩步： 1 :熒光素 +ATP -熒光素化腺苷酸（Iuciferyladenylate) +PPi 2 :熒光素化腺苷酸+O2-氧熒光素+AMP+光 這一反應(yīng)非常節(jié)省能量，幾乎所有輸入反應(yīng)的能量都被轉(zhuǎn)化為光。與之形成鮮明對(duì)比 的是人類使用的白熾燈，只有約10%的能量被轉(zhuǎn)化為光，剩余的能量都變?yōu)闊崮芏焕速M(fèi)。
[0005] 熒光素酶可以在實(shí)驗(yàn)室中用基因工程的方法生成，并被用于多種不同的實(shí)驗(yàn)。熒 光素酶的基因可以被合成并插入到生物體中或轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。研宄者利用基因工程已經(jīng)使 得小鼠、家蠶、馬鈴薯等一些生物可以合成熒光素酶。間接體外成像是一種強(qiáng)大的研宄手 段，可以對(duì)整個(gè)動(dòng)物體中的細(xì)胞群落進(jìn)行分析。
[0006] 在熒光素酶中加入正確的熒光素底物就可以放出熒光，而發(fā)出的光子可以被光敏 感元件，如熒光探測(cè)器或改進(jìn)后的光學(xué)顯微鏡探測(cè)到。這就使得對(duì)包括感染在內(nèi)的多種生 命活動(dòng)進(jìn)程進(jìn)行觀察成為可能。例如，熒光素酶可以被用于檢測(cè)血庫中所存血液中的紅血 球是否開始破裂。法醫(yī)可以用含有熒光素酶的溶液來檢測(cè)犯罪現(xiàn)場(chǎng)中殘留的血跡。醫(yī)院用 熒光素酶的發(fā)光來發(fā)現(xiàn)特定的疾病。熒光素酶還可以作為"報(bào)告蛋白"被用于分子生物學(xué) 研宄中，例如，用于在轉(zhuǎn)染過熒光素酶的細(xì)胞中檢測(cè)特定啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄情況或用于探測(cè)細(xì) 胞內(nèi)的ATP的水平；這一技術(shù)被稱為報(bào)告基因檢測(cè)法或熒光素酶檢測(cè)法。熒光素酶是一個(gè) 熱敏感蛋白，因此經(jīng)常被用于研宄蛋白熱變性過程中熱休克蛋白的保護(hù)能力。
[0007] 基因組測(cè)序是當(dāng)代生命科學(xué)技術(shù)的前沿核心技術(shù)之一，其中的焦磷酸測(cè)序法采用 了熒光素酶進(jìn)行檢測(cè)，讀長大，精確度高?，F(xiàn)有的熒光素酶純化技術(shù)中，得到的產(chǎn)物純度較 低，容易影響測(cè)序反應(yīng)的精度，不能滿足基因組測(cè)序的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的是一種純化螢火蟲熒光素酶的方法，包括以下步驟： (1) 加入金屬鹽：加入鎂鹽和鈣鹽； (2) 加入穩(wěn)定劑； (3) 有機(jī)溶劑沉淀； (4) 無菌過濾； (5) 進(jìn)行鎳柱純化； (6) 采用superdex 200進(jìn)行分子排阻。
[0009] 所述鎂鹽為硫酸鎂、氯化鎂和硝酸鎂中的一種或幾種，所述鈣鹽為硫酸鈣、氯化鈣 和硝酸鉀中的一種或幾種。
[0010] 所述步驟（1)中加入鎂鹽和鈣鹽，使鎂離子的終濃度為20-30mmol/l，鈣離子的終 濃度為 l〇_20mmol/l。
[0011] 所述穩(wěn)定劑為甘油、乙二醇、大豆多糖和二巰基蘇糖醇中的一種或幾種，優(yōu)選為大 豆多糖和二巰基蘇糖醇，穩(wěn)定劑的終濃度為5-15g/L。
[0012] 所述有機(jī)溶劑沉淀使用的有機(jī)溶劑為甲醇、乙腈和丙酮中的一種或幾種。
[0013] 所述無菌過濾使用0· 22 μ m濾膜。
[0014] 所述純化方法的步驟中，保持熒光素酶的環(huán)境溫度為16°C以下。
[0015] 所述熒光素酶帶有His-tag。
[0016] 所述鎳柱純化時(shí)，使用20_500mM的咪唑進(jìn)行梯度洗脫。
[0017] 所述superdex 200為GE分子排阻預(yù)裝柱。
[0018] 本發(fā)明中加入的鎂鹽和鈣鹽能夠增加熒光素酶的穩(wěn)定性，同時(shí)保持其在純化過程 中的高活性。穩(wěn)定劑的加入進(jìn)一步確保了熒光素酶的活性在純化過程中不受損失。DEAE Sepharose CL-6B離子交換層析柱、superdex 200分子排阻和有機(jī)溶劑沉淀相結(jié)合，能夠有 效去除酶液中的雜蛋白和其他雜質(zhì)分子。使用本方法純化得到的螢火蟲熒光素酶活力大， 純度高，催化效率高，能夠確保反應(yīng)精度，滿足基因組測(cè)序的需要，適宜廣泛應(yīng)用于基因組 測(cè)序中。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1 (1) 取IL焚光素酶粗酶液，加入氯化鎂lOmmol、硫酸鎂15mmol和氯化1? 16mmol ; (2) 加入大豆多糖6g和二巰基蘇糖醇3g ; (3) 有機(jī)溶劑沉淀：緩慢加入15ml丙酮和20ml乙腈，攪拌，靜置10分鐘，13000rpm離 心，棄去上清，加入IOml Tris-HCl緩沖液，攪拌，13000rpm離心，收集上清液； (4) 使用0. 22 μ m濾膜進(jìn)行無菌過濾； (5) 進(jìn)行鎳柱純化，使用pH7. 4的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，洗脫時(shí)使用 20-500mM的咪唑進(jìn)行梯度洗脫； (6) 采用GE分子排阻預(yù)裝柱superdex 200進(jìn)行分子排阻，使用pH7. 4的Tris-HCl緩 沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，得到酶液l〇〇ml，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥； 以上步驟均在16 °C環(huán)境下進(jìn)行。
[0020] 實(shí)施例2 (1) 取IL焚光素酶粗酶液，加入硝酸鎂20mmol、硫酸1? 12 mmol，氯化1? 8mmol ; (2) 加入甘油5g ; (3) 有機(jī)溶劑沉淀：緩慢加入20ml甲醇和12ml乙腈，攪拌，靜置10分鐘，13000rpm離 心，棄去上清，加入IOml Tris-HCl緩沖液，攪拌，13000rpm離心，收集上清液； (4) 使用0. 22 μ m濾膜進(jìn)行無菌過濾； (5) 進(jìn)行鎳柱純化，使用pH7. 4的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，洗脫時(shí)使用 20-500mM的咪唑進(jìn)行梯度洗脫； (6) 采用GE分子排阻預(yù)裝柱superdex 200進(jìn)行分子排阻，使用pH7. 4的Tris-HCl緩 沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，得到酶液l〇〇ml，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥； 以上步驟（5)和（6)在4°C下進(jìn)行，其他步驟均在16°C環(huán)境下進(jìn)行。
[0021] 實(shí)施例3 (1) 取IL焚光素酶粗酶液，加入氯化鎂30mmol、硫酸1? 2 mmol、氯化1? 4mmol和硝酸媽 4mmol ； (2) 加入甘油8g、乙二醇2g和大豆多糖5g ; (3) 有機(jī)溶劑沉淀：緩慢加入30ml乙腈，攪拌，靜置10分鐘，13000rpm離心，棄去上清， 加入IOml Tris-HCl緩沖液，攪拌，13000rpm離心，收集上清液； (4) 使用0. 22 μ m濾膜進(jìn)行無菌過濾； (5) 進(jìn)行鎳柱純化，使用pH7. 4的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，洗脫時(shí)使用 20-500mM咪唑進(jìn)行梯度洗脫； (6) 采用GE分子排阻預(yù)裝柱superdex 200進(jìn)行分子排阻，使用pH7. 4的Tris-HCl緩 沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，得到酶液l〇〇ml，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥； 以上步驟（5)和（6)在4°C下進(jìn)行，其他步驟均在16°C環(huán)境下進(jìn)行。
[0022] 實(shí)施例4 (1) 取IL焚光素酶粗酶液，加入硫酸鎂28mmol、氯化1? 5mmol和硝酸1? 6mmol ; (2) 加入甘油6g、乙二醇5g、大豆多糖Ig和二巰基蘇糖醇I. 5g ; (3) 有機(jī)溶劑沉淀：緩慢加入IOml乙腈、IOml丙酮和16ml甲醇，攪拌，靜置10分鐘， 13000rpm離心，棄去上清，加入IOml Tris-HCl緩沖液，攪拌，13000rpm離心，收集上清液； (4) 使用0. 22 μ m濾膜進(jìn)行無菌過濾； (5) 進(jìn)行鎳柱純化，使用pH7. 4的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，洗脫時(shí)使用 20-500mM咪唑進(jìn)行梯度洗脫； (6) 采用GE分子排阻預(yù)裝柱superdex 200進(jìn)行分子排阻，使用pH7. 4的Tris-HCl緩 沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，得到酶液l〇〇ml，蒸發(fā)干燥； 以上步驟均在16 °C環(huán)境下進(jìn)行。
[0023] 對(duì)比例1 (1) 取IL熒光素酶粗酶液，加入硫酸鎂3mmol和氯化鈣5mmol ; (2) 加入甘油Ig ; (3) 有機(jī)溶劑沉淀：緩慢加入6ml甲醇，攪拌，13000rpm離心，棄去上清，加入IOml Tris-HCl緩沖液，攪拌，13000rpm離心，收集上清液； (4) 使用0. 22 μ m濾膜進(jìn)行無菌過濾； (5)進(jìn)行鎳柱純化，使用pH6. 5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行柱平衡和洗脫，洗脫時(shí)使用 20-500mM咪唑進(jìn)行梯度洗脫，干燥； 以上步驟均在26°C環(huán)境下進(jìn)行。
[0024] 對(duì)實(shí)施例1、實(shí)施例2和對(duì)比例1進(jìn)行產(chǎn)物酶純度的測(cè)定，結(jié)果如下：
表1 由表1可知，本發(fā)明中得到的產(chǎn)物純度顯著高于對(duì)比例1，達(dá)到了 98. 62%，而由不同條 件得到的對(duì)比例1產(chǎn)物純度僅為95. 36%。高純度的熒光素酶能夠確保測(cè)序反應(yīng)的順利進(jìn) 行。
[0025] 上述詳細(xì)說明是針對(duì)本發(fā)明其中之一可行實(shí)施例的具體說明，該實(shí)施例并非用以 限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明技術(shù) 方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種純化螢火蟲熒光素酶的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 加入金屬鹽：加入鎂鹽和鈣鹽； (2) 加入穩(wěn)定劑； (3) 有機(jī)溶劑沉淀； (4) 無菌過濾； (5) 進(jìn)行鎳柱純化； (6) 采用superdex 200進(jìn)行分子排阻。2. 如權(quán)利要求1所述的純化螢火蟲熒光素酶的方法，其特征在于，所述鎂鹽為硫酸鎂、 氯化鎂和硝酸鎂中的一種或幾種，所述鈣鹽為硫酸鈣、氯化鈣和硝酸鉀中的一種或幾種。3. 如權(quán)利要求1所述的純化螢火蟲熒光素酶的方法，其特征在于，所述步驟（1)中加入 鎂鹽和媽鹽，使鎂離子的終濃度為20-30_〇1/1，媽離子的終濃度為10-20_〇1/1。4. 如權(quán)利要求1所述的純化螢火蟲熒光素酶的方法，其特征在于，所述穩(wěn)定劑為甘油、 乙二醇、大豆多糖和二巰基蘇糖醇中的一種或幾種，優(yōu)選為大豆多糖和二巰基蘇糖醇。5. 如權(quán)利要求1所述的純化螢火蟲熒光素酶的方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑沉淀 使用的有機(jī)溶劑為甲醇、乙腈和丙酮中的一種或幾種。6. 如權(quán)利要求1所述的純化螢火蟲熒光素酶的方法，其特征在于，所述無菌過濾使用 0? 22 ym 濾膜。7. 如權(quán)利要求1所述的純化螢火蟲熒光素酶的方法，其特征在于，所述純化方法的步 驟中，保持熒光素酶的環(huán)境溫度為16°C以下。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種純化螢火蟲熒光素酶的方法。包括以下步驟：加入金屬鹽和穩(wěn)定劑，進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀，過濾，采用鎳柱和分子篩。本方法設(shè)計(jì)合理，使用本方法純化得到的螢火蟲熒光素酶活力大，催化效率高，能夠廣泛應(yīng)用于基因組測(cè)序中。
【IPC分類】C12N9/02
【公開號(hào)】CN104946607
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510414398
【發(fā)明人】高靜, 蔡亦梅, 徐瀟, 吳超, 張睿, 王者馥, 王緒敏, 殷金龍, 任魯風(fēng)
【申請(qǐng)人】北京中科紫鑫科技有限責(zé)任公司
【公開日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年7月15日