重組溶瘤腺病毒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和基因治療領(lǐng)域，具體地說，涉及一種新型的重組溶瘤腺病 毒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤的發(fā)展是多因素參與的動態(tài)過程，多年來對腫瘤基因治療研宄的經(jīng)驗表 明，怎樣在與惡性腫瘤的競速中取得完勝是實現(xiàn)有效治療的關(guān)鍵。因此，應(yīng)以惡性腫瘤發(fā) 生、發(fā)展過程中的多因素、特殊性為切入點，使抑瘤過程達到動態(tài)平衡，最終實現(xiàn)準確快速 抑瘤，有效治療惡性腫瘤。
[0003] 手術(shù)治療、化療和放療是目前腫瘤治療的首選方式，但會對機體造成不可逆創(chuàng)傷 和生理的次生影響，且根治不完全。因此，在抗腫瘤新方法研宄伊始，即應(yīng)摒棄拆東補西的 傳統(tǒng)方案，通過將特異性作為研宄重點達到候選藥物的安全性、特異性和有效性。
[0004] 多數(shù)化療藥物和射線通過p53基因發(fā)揮作用，而各類腫瘤中50~60%存在p53基 因突變，從而嚴重影響治療效果。另外，bcl-2基因可抑制細胞凋亡，因此成為一些腫瘤化 療耐藥的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，探索不依賴P53且不受bcl-2基因影響的新型抗腫瘤生物效應(yīng) 物質(zhì)，從根本上解決某些惡性腫瘤患者的耐藥問題，成為亟待解決的問題。
[0005] 惡性腫瘤超過100種，幾乎可以發(fā)生在機體的任何部位。全世界70%的惡性腫瘤 死亡病例發(fā)生在中低收入國家，發(fā)達國家以不計成本的方式治療只能將個別惡性腫瘤類型 的5年平均生存率提高至50~60%。宮頸癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等惡性腫瘤，若發(fā)現(xiàn)及時， 輔以適當療法，可以得到有效治療。由于目前的公共衛(wèi)生水平、醫(yī)療質(zhì)量和診治費用等諸多 限制，將使極易控制的惡性腫瘤也難以得到有效治療，最終使中國成為名副其實的"癌癥大 國"。因此，在研發(fā)抗腫瘤候選藥物過程中，應(yīng)充分考慮生產(chǎn)成本和患者承受能力。
[0006] 近年來，以基因治療、體細胞治療、抗體治療和生物化療為研宄重點的腫瘤生物治 療發(fā)展迅速，其中又以基因治療研宄最為廣泛?；蛑委熭d體主要包括非病毒載體和病毒 載體兩類。非病毒載體副作用小，但低下的轉(zhuǎn)導效率和瞬時表達的特點使其發(fā)展受限。因 此，75%以上的基因治療研宄應(yīng)用病毒載體。腫瘤基因治療的成功不僅在于其有效性，特異 性也是重要的評測指標之一。在很多永生化細胞系中發(fā)現(xiàn)一些基因拷貝數(shù)增加，說明存在 腫瘤特異性啟動子。腫瘤特異性啟動子可在腫瘤細胞內(nèi)驅(qū)動基因高水平表達，提示該類啟 動子的高效性和特異性適用于在腫瘤細胞中靶向表達，為腫瘤基因治療的臨床應(yīng)用提供了 新策略。
[0007] 凋亡素是來源于雞貧血病病毒的一種小分子蛋白。凋亡素能夠在不影響正常細胞 的前提下，特異性地誘導多種腫瘤細胞凋亡。另外，多數(shù)化療藥物和射線是通過野生型P53 誘導細胞凋亡的，而50~60%的腫瘤類型存在p53基因突變，因此嚴重影響治療效果。研 宄發(fā)現(xiàn)，無論腫瘤細胞的P53基因是否存在突變，凋亡素能夠有效地誘導腫瘤細胞凋亡。另 外，bcl-2基因的過表達可抑制細胞凋亡，因此bcl-2的過表達也成為一些腫瘤細胞對化療 藥物產(chǎn)生耐藥性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。而研宄發(fā)現(xiàn)，bcl-2基因的過表達不僅對凋亡素的凋亡 誘導作用無影響，反而能增強其凋亡誘導功能。這種促進作用不是二者直接作用的結(jié)果，因 為即使正常細胞過表達bcl-2,凋亡素也不會對其產(chǎn)生影響。因此，凋亡素可以有效地避免 耐藥性的產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種新型的重組溶瘤腺病毒，用于腫瘤的治療。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供重組溶瘤腺病毒在制備和治療腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明提供的重組溶瘤腺病毒，包括溶瘤腺病毒載體和插入其中的表達盒，所述 表達盒包括由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子（hTERTp)與Ela基因組成的表達盒以及由真核啟 動子與雞貧血病病毒VP3基因組成的表達盒。
[0011] 其中，所述雞貧血病病毒VP3基因，第209位核苷酸由胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏ぃ?347位核苷酸由鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰?，?52位核苷酸由胸腺嘧啶突變?yōu)榘奏ぃ浜塑账?序列如Seq ID No. 1所示。
[0012] 所述人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子，其第220位核苷酸為胞嘧啶，第266位核苷酸為鳥 嘌呤，第268位核苷酸為鳥嘌呤，其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0013] 本發(fā)明采用突變的VP3基因，有效提高了其抗腫瘤能力，采用突變的人端粒酶逆 轉(zhuǎn)錄酶啟動子，有效提高了其穩(wěn)定性。
[0014] 本發(fā)明中使用的真核啟動子優(yōu)選為人類巨細胞病毒啟動子，所述溶瘤腺病毒載體 源自人5型腺病毒。
[0015] 優(yōu)選地，本發(fā)明的重組溶瘤腺病毒，由溶瘤腺病毒載體、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動 子、Ela基因、人類巨細胞病毒啟動子、雞貧血病病毒VP3基因和多聚腺苷酸序列組成。
[0016] 更優(yōu)選地，本發(fā)明的重組溶瘤腺病毒，其序列如Seq ID No. 3所示。
[0017] 本發(fā)明還提供所述重組溶瘤病毒在制備抗腫瘤藥物和預防術(shù)后腫瘤復發(fā)藥物中 的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明進一步提供由所述重組溶瘤病毒制備的抗腫瘤藥物和預防術(shù)后腫瘤復發(fā) 藥物。所述藥物可制備成注射劑、噴霧劑或涂抹劑等劑型。
[0019] 本發(fā)明提供的新型重組溶瘤病毒具有腫瘤特異性復制和腫瘤特異性殺傷的雙重 特異性，可以在腫瘤細胞內(nèi)特異性復制，同時表達對腫瘤細胞具有特異性殺傷能力的凋亡 素基因，從而通過增強腫瘤特異性提高其安全性。同時，通過重組溶瘤病毒的復制和凋亡素 基因本身的殺傷能力，提尚其腫瘤殺傷能力。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實施例3中72小時MTT實驗檢測不同濃度抑制結(jié)果。
[0021] 圖2為本發(fā)明實施例3中100M0I時MTT實驗檢測不同時間抑制結(jié)果。
[0022] 圖3為本發(fā)明實施例4中模型動物腫瘤生長趨勢實驗結(jié)果。
[0023] 圖4為本發(fā)明實施例4中模型動物平均存活期實驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0024] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例中大腸桿菌感受態(tài)細胞的 制備與轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的提取及限制性內(nèi)切酶消化、DNA片段的回收、線性DNA片段的連接、重組 質(zhì)粒的篩選與鑒定、PCR擴增反應(yīng)等參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實驗指南》第二版相 關(guān)章節(jié)進行。
[0025] 實施例1重組溶瘤腺病毒穿梭載體質(zhì)粒的制備
[0026] UEla基因的克隆
[0027] 根據(jù)GenBank中公開的人5型腺病毒Ela基因序列（NC_001406)，設(shè)計如下引物， 用于擴增Ela基因：
[0028] Ela 上游引物：5' -GCCTGCAGACCACCATGGGACATATTATCTGCCAC-3'
[0029] Ela 下游引物：5' -GCGGATCCTTATGGCCTGGGGCGTTTACAGC-3'
[0030] 優(yōu)化各步反應(yīng)條件及參與反應(yīng)試劑的最佳濃度，在PCR儀上進行DNA擴增。反應(yīng)總 體積50 μ L : 10 XPCR緩沖液5 μ L、20 μ mol/L上。下游引物各1 μ L，模板DNA5 μ UdNTP (各 2.5mmol/L)5yL，25mmol/L MgCl24yL，lU/yL Ex-Taq DNA 聚合酶 IyUddH2O 27yL。篩選 并確定 PCR 工作程序：94°C 4min ;然后 94°C 30s，57°C 45s，72°C lmin，10 個循環(huán)；最后 72°C 延伸lOmin，4°C保溫。擴增產(chǎn)物分別連接至pMD18-T載體上，并對所構(gòu)建的質(zhì)粒pMD18-Ela 進行核苷酸序列測定。
[0031] 2、VP3基因的克隆
[0032] 根據(jù)GenBank中公開的VP3基因序列（NC_001427)，設(shè)計如下引物，將第209位核 苷酸由胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?，?47位核苷酸由鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰?，?52位核苷酸由 胸腺嘧啶突變?yōu)榘奏?，用于擴增VP3基因：
[0033] Apoptin 上游引物：5' -GCGATATCACCACCATGGACGCTCTCCAA-3'
[0034] Apoptin 下游引物：5' -GCGAATTCTTACAGTCTTATACGCCTTTTTGCGGTTCGGGGTCGGCTGG GAGTAGTGGTAATCAAGCTTTCTTTTAGCTCGCTTACCCTGTACTCGGAGGGGTCGCAGGATCGCTTCTTCGAGGGA GGCTTGGGTTGATCGGTCCTCAAGTCCGGCACATTCTTGAAACCA-3 ,
[0035] 優(yōu)化各步反應(yīng)條件及參與反應(yīng)試劑的最佳濃度，在PCR儀上進行DNA擴增。反應(yīng)總 體積50 μ L : 10 X PCR緩沖液5yL、20ymol/L上、下游引物各lyL，模板DNA5 μ UdNTP (各 2.5mmol/L)5yL，25mmol/L MgCl24yL，lU/yL Ex-Taq DNA 聚合酶 IyUddH2O 27yL。篩選 并確定 PCR 工作程序：94°C 4min ;然后 94°C 30s，57°C 45s，72°C lmin，10 個循環(huán)；最后 72°C 延伸lOmin，4°C保溫。擴增產(chǎn)物分別連接至pMD18-T載體上，并對所構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-VP3進 行核苷酸序列測定。
[0036] 3、腫瘤特異性啟動子的合成
[0037] 分別根據(jù)GenBank中公開的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERT(EU650197)核苷酸序 列人工合成hTERT啟動子，第220位核苷酸為胞嘧啶，第266位核苷酸為鳥嘌呤，第268位 核苷酸為鳥嘌呤，并將其連接于PKS載體（購自Stratagen公司），構(gòu)建含有hTERTp的質(zhì)粒 pKS-hTERT。
[0038] 4、穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
[0039] Pst I/BamH I雙酶切質(zhì)粒pMD18-Ela，獲得Ela基因片段，并與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì) 粒pKS-hTERTp連接，構(gòu)建質(zhì)粒pKS-hTERTp-El。然后Xba I/Xho I雙酶切質(zhì)粒pIRES-neo (購 自Invitrogen公司），獲得Poly A核苷酸片段，補平，與經(jīng)Hind III酶切并補平的 pKS-hTERTp-El 連接，構(gòu)建質(zhì)粒 pKS-PolyA-hTERTp-El。
[0040] Hind III 酶切質(zhì)粒 pacAd5CMV K-N pA，補平后用 EcoR I 酶切，與經(jīng) EcoR I/EcoR V雙酶切PMD18-VP3后獲得的VP3基因片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒pAd-VP3。
[0041] BamH I酶切pAd-VP3,補平后用Spe I酶切，回收線性化的pAd-VP3 ;Xho I酶 切pKS-PolyA-hTERTp-El，補平后用Spe I酶切，獲得含-PolyA-hTERTp-Ela核