一種棉花抗旱基因GhSNAC1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種棉花抗旱基因 GhSNACl及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 干旱嚴(yán)重影響作物的生長(zhǎng)發(fā)育，在諸多自然災(zāi)害中，干旱造成的損失最為嚴(yán)重。我 國二分之一的國土面積為干旱和半干旱地區(qū)，即使非干旱地區(qū)，也會(huì)時(shí)常遭受干旱危害。尤 其近些年來，隨著城鎮(zhèn)化的不斷推進(jìn)和人口的增加，耕地面積不斷減少，淡水資源也日益匱 乏，如何在干旱條件下提高植物水分利用效率，最大限度的保證作物生產(chǎn)，成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中 亟需解決的重大課題。已有研宄發(fā)現(xiàn)，植物在適應(yīng)干旱脅迫的過程中，可以通過調(diào)節(jié)自身形 態(tài)、生理或代謝變化來抵御干旱。目前，在擬南芥和水稻等模式植物中，已經(jīng)克隆了眾多響 應(yīng)干旱脅迫的功能基因，其中轉(zhuǎn)錄因子由于能夠調(diào)節(jié)多個(gè)脅迫響應(yīng)功能基因的表達(dá)而備受 關(guān)注。
[0003] 我國是全球最大的棉花生產(chǎn)國和消費(fèi)國，棉花行業(yè)在國民經(jīng)濟(jì)和棉區(qū)的經(jīng)濟(jì) 發(fā)展中具有舉足輕重的作用。但是，我國棉區(qū)也是主要的糧食生產(chǎn)區(qū)，糧棉爭(zhēng)地矛盾突 出。為了保證棉花的有效供給，我們棉花正在向鹽堿地、旱地和瘠薄地發(fā)展。因此，提高 棉花的抗旱耐鹽能力具有更加重要的現(xiàn)實(shí)意義。棉花NAC轉(zhuǎn)錄因子研宄起步較晚，且相 關(guān)研宄主要集中在我國科學(xué)家中。2009年，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的郭旺珍教授課題組利用生物 信息學(xué)和RT-PCR等方法率先從陸地棉中克隆了 6個(gè)NAC基因，命名為GhNAC I -GhNAC6。 GhNACl-GhNAC6主要在葉片中表達(dá)，GhNAC2和GhNAC3受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，GhNAC5受低溫和干 旱誘導(dǎo)表達(dá)，GhNAC4和GhNAC6受低溫、干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。2013年華中師范大學(xué)李學(xué) 寶教授課題組克隆了 7個(gè)逆境相關(guān)NAC基因，命名為GhNAC7-GhNAC13, qPCR分析發(fā)現(xiàn)這7 個(gè)GhNAC基因主要在根中表達(dá)，并受ABA和高鹽誘導(dǎo)表達(dá)。2013年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研 宄所喻樹迅院士課題組克隆了 10個(gè)NAC基因，命名為GhNAC8-GhNAC17, qPCR分析發(fā)現(xiàn)它們 受葉片衰老、干旱、高鹽、低溫、高溫、ABA和乙烯等誘導(dǎo)表達(dá)。2014年喻樹迅院士課題組利 用生物信息學(xué)和RT-PCR方法從陸地棉中鑒定了 61個(gè)NAC基因，命名為GhNAC18-GhNAC78， 發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)GhNAC基因的表達(dá)具有組織特異性，部分GhNAC基因的表達(dá)受乙烯、ABA、GA、 干旱、鹽漬和衰老等誘導(dǎo)表達(dá)。截止目前，我國科學(xué)家們已經(jīng)克隆了近80個(gè)陸地棉NAC基 因，并分析了其在多種組織、多種激素和逆境處理下的表達(dá)變化，但具體功能研宄尚未見到 報(bào)道。我們以NAC結(jié)構(gòu)域的保守序列為探針，搜索棉花EST和nucleotide序列，對(duì)得到的 匹配序列進(jìn)行拼接和進(jìn)化分析，挖掘逆境相關(guān)NAC序列，然后利用RT-PCR克隆棉花逆境相 關(guān)NAC基因，并分析其在干旱、鹽害、低溫和黃萎病脅迫下的表達(dá)變化，篩選脅迫誘導(dǎo)表達(dá) 的NAC基因，構(gòu)建過量表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)化煙草和棉花研宄其在逆境脅迫 用的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種棉花抗旱基因 GhSNACl，該基因過量表達(dá)株的保水能 力增強(qiáng)，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株的根系的長(zhǎng)度得到了增長(zhǎng)，說明轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫下抗逆性 增強(qiáng)?？梢岳帽景l(fā)明基因構(gòu)建成各種植物表達(dá)載體，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種以提高作 物抗旱性狀。
[0005] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 本發(fā)明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一種棉花抗旱基因 GhSNACl，其核 苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
[0007] 本發(fā)明還提供了所述的棉花抗旱基因 GhSNACl編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為 SEQ ID NO. 2。
[0008] 進(jìn)一步，本發(fā)明還包括含有所述抗旱基因 GhSNACl的表達(dá)載體 pCAMBIA3301-GhSNACl，所述的表達(dá)載體通過pCAMBIA3301構(gòu)建，構(gòu)建過程中的引物分別 為：SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4。
[0009] 本發(fā)明提供了所述的抗旱基因 GhSNACl和表達(dá)載體pCAMBIA 3301-GhSNACl在培 育GhSNACl基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0010] 所述的植物為單子葉植物或雙子葉植物，其中較優(yōu)選為煙草或棉花。
[0011] 本發(fā)明的有益效果為：將實(shí)驗(yàn)證明，在模擬干旱（18%的PEG6000)脅迫2h后， GhSNACl基因的表達(dá)量顯著提高，預(yù)示其可能在抵御干旱脅迫中起作用。進(jìn)一步通過構(gòu)建表 達(dá)載體PCAMBIA3301-G hSNACl，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404,結(jié)果表明過量表達(dá)GhSNACl基因的 轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下抗逆性增強(qiáng)。 圖1是GhSNACl基因的結(jié)構(gòu)； 圖2是不同脅迫處理下GhSNACl基因的表達(dá)分析； 圖3是不同干旱脅迫時(shí)間下GhSNACl基因的表達(dá)變化； 圖4是轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)； 圖5是轉(zhuǎn)基因植株的qPCR分析； 圖6是野生型和轉(zhuǎn)GhSNACl基因煙草的離體葉片失水率比較； 圖7是模擬干旱條件下轉(zhuǎn)基因煙草的根系生長(zhǎng)比較； 圖8是干旱條件下轉(zhuǎn)GhSNACl基因煙草的表型變化。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0013] 實(shí)施例1 GhSNACl的克隆
[0014] 1.1植物材料
[0015] 魯棉研32是由魯1565系（石368X澳A93-14組合后代選系）與魯棉研18號(hào) 雜交后經(jīng)系統(tǒng)選育而成的，具有抗枯萎病、耐黃萎病和耐鹽堿等特點(diǎn)。棉籽用1%的次氯酸 鈉表面消毒15min，無菌水充分沖洗，于蒸餾水中浸泡12h，使種子充分吸水，吸脹后的種子 鋪在洗水棉中于黑暗、28°C條件下發(fā)芽，發(fā)芽后轉(zhuǎn)移至Hoagland營養(yǎng)液中生長(zhǎng)，待幼苗長(zhǎng) 出2-3片真葉時(shí)分別進(jìn)行以下處理：CK(Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)）、PEG(10% PEG6000溶液）、 Salt(150mm〇l/L Na Cl溶液）、Wilt (黃萎病菌液侵染，采用具有高致病力的落葉型黃萎病 菌系VD8,孢子懸浮液濃度約I X IO7個(gè)/mL)和LT (4°C低溫處理），處理時(shí)間均為2h，剪取 根系用作實(shí)驗(yàn)材料，液氮速凍，保存于_80°C冰箱備用。
[0016] 1. 2棉花根系RNA提取和GhSNACl基因克隆
[0017] 根系RNA提取采用改進(jìn)的CTAB法，cDNA的合成按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄合成試劑 盒說明書步驟進(jìn)行。GhSNACl基因克隆引物為GhSNAClF(5' -ATGGTAGTCCCGGAAACTGAT-3'） 和 GhSNAClR(5, -AATTCCATACCTCTTTCCCCC-3'）。RT-PCR 擴(kuò)增參照 TaKaRa 公司試劑盒說明 書步驟進(jìn)行。獲得的PCR產(chǎn)物克隆到T載體中，陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有 限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST檢索序列數(shù)據(jù)庫，確定所克隆序列為棉花NAC類基因編碼 序列。
[0018] 二倍體雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii)基因組測(cè)序已經(jīng)完成，Jin等（2014) 利用生物信息學(xué)方法從G.raimondii基因組中預(yù)測(cè)了 266個(gè)NAC基因 （PlantTFDB 3.0， http://planttfdb. cbi. pku. edu. cn/index. php)。我們發(fā)現(xiàn) Gorai. 009G433200. 1 基因 與抗旱NAC轉(zhuǎn)錄因子ANAC072、ANACO19、ANAC055和SNACl的序列一致性分別高達(dá)63 % (E 彡 8e-142)、58% (E 彡 le-130)、68% (E 彡 6e-128)和 57% (E 彡 5e-85)，因而推測(cè)其可 能在植物響應(yīng)干旱脅迫中起作用。
[0019] 以Gorai. 009G433200. 1基因序列為模板，我們利用基因特異引物GhSNAClF和 GhSNAClR，在魯棉研32號(hào)克隆了 一個(gè)與NAC類基因同源的cDNA序列，命名為GhSNACl，該序 列長(zhǎng)度為l〇75bp，具有單一的完整開放閱讀框，推測(cè)編碼蛋白含有342個(gè)氨基酸，分子量為 38. 3kDa，等電點(diǎn)為 8. 85。InterProScan 5(http://www. expasy.org/)軟件分析發(fā)現(xiàn)在第 14-139氨基酸之間存在NAC保守結(jié)構(gòu)域（圖1)。
[0020] 實(shí)施例2 GhSNACl基因的表達(dá)分析
[0021] 用qPCR分析GhSNACl基因的表達(dá)情況。qPCR按照Takara公司S YBR? Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進(jìn)行。上游引物為5 ' -GTTCCCAGTGGACAAACTCAGAC-3 '，下游引 物為 5' -CTTAAACACAAACCCACCCGAC-3'。以棉花泛素蛋白（Ubiquitin)基因 UBQ7 (Acc. No. AY-189972)為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系為25 μ L。qPCR共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：95°C 30s，95°C 5s， 60