基因ehd2在制備乳腺癌免疫組化診斷試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是EHD2的表達(dá)與亞細(xì)胞定位與乳腺癌患者的生 存具有顯著相關(guān)性，可以作為乳腺癌惡性度診斷和預(yù)后預(yù)判的一個(gè)分子指標(biāo)。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性常見惡性腫瘤。全世界每年有一百萬婦女患病，自20世紀(jì)70年代 末開始、我國乳腺癌的發(fā)病率一直居女性腫瘤的首位。北美、北歐原是乳腺癌的高發(fā)區(qū)，現(xiàn) 在我國的發(fā)病率也從五年前的十萬分之十七增加到去年的十萬分之五十二，呈快速上升趨 勢(shì)，而且發(fā)病年齡也越來越年輕化，年齡最小的只有十四歲。引發(fā)乳腺癌的因素是多方面 的，除遺傳因素外還有環(huán)境因素、精神因素及工作壓力太大等因素。而且經(jīng)濟(jì)越發(fā)達(dá)的城市 發(fā)病率越高于農(nóng)村。目前世界各國投入較大的精力和物力來研究該病的發(fā)生、發(fā)展，以便采 取積極的預(yù)防措施。
[0003] 目前在臨床上對(duì)腫瘤的惡性度判別主要還是基于在組織病理水平對(duì)腫瘤組織和 腫瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察，它對(duì)癌細(xì)胞的分化程度和侵犯特性有較強(qiáng)的辨別能力，準(zhǔn) 確率可達(dá)50%_75%。然而，這種基于形態(tài)學(xué)的解讀一方面受病理醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)等人為因素影響， 另一方面缺乏更深層次的與病人個(gè)體發(fā)病因素相關(guān)的分子依據(jù)，因此亟需與現(xiàn)代分子技術(shù) 相結(jié)合，才能提高判斷的準(zhǔn)確性和特異性，特別是為個(gè)體化治療路徑與方案的選擇提供理 論依據(jù)。
[0004] 雖然腫瘤的發(fā)生與多種因素相關(guān)，但最終的根源主要來自于基因水平的異常變 化，包括基因的擴(kuò)增、突變、缺失、異位等等，導(dǎo)致維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)所需的多個(gè)功能蛋 白在表達(dá)水平的高低、生化活性的強(qiáng)弱、甚至亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分布等方面產(chǎn)生變化，當(dāng)這種變化 賦予了細(xì)胞無限增殖能力及轉(zhuǎn)移能力，并不能被體內(nèi)外保護(hù)機(jī)制逆轉(zhuǎn)或殺滅時(shí)，便產(chǎn)生了 腫瘤。因此，對(duì)腫瘤惡性本質(zhì)的深刻認(rèn)識(shí)和有效控制的前提是明確這些功能蛋白分子的異 變情況，這需要借助免疫組織化學(xué)的手段。
[0005] 免疫組織化學(xué)技術(shù)應(yīng)用免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)基本原理，通過抗體對(duì)體內(nèi)蛋白質(zhì)分 子抗原的特異性識(shí)別，以及化學(xué)標(biāo)記（熒光素、酶、金屬離子、同位素等）的第二抗體的顯色 等作用來檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)抗原（多肽和蛋白質(zhì)）的表達(dá)量及其亞細(xì)胞定位。近年來， 隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的成功研發(fā)，更主要的是對(duì)腫瘤分子機(jī)制 認(rèn)識(shí)的不斷深入，免疫組化在腫瘤診斷與鑒別中的應(yīng)用價(jià)值受到了普遍的認(rèn)可。比如雌激 素受體ER、孕激素受體PR和表皮生長因子受體家族的Her2已經(jīng)被廣泛用于乳腺癌的臨床 分子病理診斷，它對(duì)乳腺癌的病理分類和臨床用藥起到了積極的指導(dǎo)作用。這些成果離不 開腫瘤基礎(chǔ)研究的進(jìn)步，并期待新的分子指標(biāo)被進(jìn)一步揭不和納入臨床應(yīng)用，不斷提1?腫 瘤診治水平。EHD2基因及其編碼蛋白即可能是這種新的分子指標(biāo)。
[0006] EHD2(Epsin homology(EH)-domain-containing proteins)屬于EHD蛋白的一種， 是一類新型膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白，含有高度保守的EH結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域是一個(gè)含有約一百個(gè) 氨基酸殘基的片段，早先發(fā)現(xiàn)于EGFR的激酶底物Epsl5 (Epdemal Growth Factor Receptor Pathway Substrate ClonelShEHDZ參與胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的各步調(diào)控，包括內(nèi)轉(zhuǎn)及前、后內(nèi)含體的 過渡和調(diào)控循環(huán)通路；膜及膜蛋白的各路調(diào)節(jié)，包括消化降解及循環(huán)再生。是整個(gè)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn) 機(jī)制的必不可少的重要環(huán)節(jié)，對(duì)在各種細(xì)胞活動(dòng)中維護(hù)物料傳輸信號(hào)傳導(dǎo)的動(dòng)態(tài)平衡起著 關(guān)鍵的作用，它的失調(diào)將導(dǎo)致信號(hào)應(yīng)答失當(dāng)，細(xì)胞功能紊亂，并可能進(jìn)而引發(fā)疾病。
[0007] 中國文獻(xiàn)"EHD2干擾影響永生化乳腺上皮細(xì)胞的增殖和遷移"（王洪玉等，中國腫 瘤臨床，2011年第38卷第11期，）公開了在乳腺腫瘤中EHD2的基因表達(dá)失調(diào)下降，提示該 基因可能是一個(gè)新的乳腺抑癌基因。然而在進(jìn)一步免疫組化研究中我們發(fā)現(xiàn)，雖然EHD2在 總體表達(dá)量上呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但這種趨勢(shì)主要在核中；相反，細(xì)胞漿中的表達(dá)卻有升高的 趨勢(shì)。而且，EHD2在核中的表達(dá)水平與患者的生存情況密切相關(guān)。因此對(duì)EHD2進(jìn)行免疫 組化檢測(cè)將更客觀準(zhǔn)確地反映腫瘤的異化本質(zhì)和患者個(gè)體的臨床預(yù)后情況。
[0008] 現(xiàn)有的商業(yè)化EHD2抗體有十余種，由主流抗體試劑公司Santa Cruz和Abcam等 提供，但是均屬于基礎(chǔ)研究用試劑，沒有依據(jù)表明這些抗體可以和我們的抗體一樣具有合 格的特異性并可用于免疫組化檢測(cè)，特別是目前尚沒有任何其它EHD2抗體經(jīng)過大量組織 標(biāo)本的免疫組化驗(yàn)證并顯示出可以通過對(duì)EHD2的亞細(xì)胞異常定位檢測(cè)來達(dá)到對(duì)腫瘤的惡 性度及患者生存情況進(jìn)行預(yù)后預(yù)判的目的。與本專利申請(qǐng)抗體相比它們有如下缺陷：
[0009] 1、根據(jù)本領(lǐng)域公知常識(shí)，能夠用于免疫組化（IHC)的抗體會(huì)在其使用說明中作 出明確標(biāo)識(shí)和注明，按這些抗體的說明所示，大多數(shù)都不能用于免疫組化（IHC)檢測(cè)。雖 然個(gè)別抗體標(biāo)明可用于免疫組化（IHC)，但仔細(xì)研究發(fā)現(xiàn)并非如此。一個(gè)是南京森貝伽公 司代理的EHD2抗體，但是注明了只能檢測(cè)膜定位。另一個(gè)是Proteintech公司的貨號(hào)為 11440-1-AP的抗體，然而此抗體的特異性存在問題：首先免疫印跡檢測(cè)得到的主要信號(hào)位 置明顯小于60kD，而70kD的正常位置信號(hào)卻很弱，說明雖然可以檢測(cè)到EHD2,但更多檢測(cè) 到的是其它未知分子；其次從公司發(fā)表的該抗體對(duì)肺癌組織的免疫組化圖中可見染色信號(hào) 為明顯的基質(zhì)成分的非特異性著色。
[0010] 2、這些抗體均為研究用試劑，沒有經(jīng)過大樣本臨床病例試驗(yàn)或驗(yàn)證，沒有關(guān)鍵的 對(duì)EHD2的核定位檢測(cè)能力，因此也就沒有"通過對(duì)EHD2的亞細(xì)胞異常定位檢測(cè)來達(dá)到對(duì)腫 瘤的惡性度及患者生存情況進(jìn)行預(yù)后預(yù)判的目的"的前提條件與基礎(chǔ)。
[0011] 3、均沒有經(jīng)過嚴(yán)格的免疫印跡特異性驗(yàn)證，特別是與EHD2蛋白的同源蛋白EHD1、 EHD3、EHD4的交叉反應(yīng)的免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，而這些驗(yàn)證對(duì)EHD2的免疫組化檢測(cè)方法來說 尤其重要，因?yàn)樗鼈冎g具有很高的同源性（>70%)。
[0012] 中國文獻(xiàn)"EHD2下調(diào)促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究"(田剛等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志， 2012年第27卷第1期，49-51)公開了一種由其自制的EHD2抗體，這一抗體是采用我們的 沒有經(jīng)過抗原純化的抗體，可以用于免疫印跡檢測(cè)，但不能滿足免疫組化檢測(cè)的高度特異 性要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 我們?cè)诿庖呓M化研究中發(fā)現(xiàn)，正常上皮細(xì)胞中EHD2主要分布在細(xì)胞核，同時(shí)細(xì)胞 漿與膜中也有少量表達(dá)。但在乳腺癌組織中，EHD2的定位發(fā)生異變，核分布顯著下降，漿 與膜分布卻出現(xiàn)升高的趨勢(shì)。臨床因素分析結(jié)果表明，EHD2的核分布情況與患者預(yù)后緊密 相關(guān)，核表達(dá)越弱則患者的生存情況越差。這些發(fā)現(xiàn)表明乳腺癌的惡性度與癌組織細(xì)胞中 EHD2蛋白的表達(dá)位置和表達(dá)水平發(fā)生異變的程度密切關(guān)聯(lián)，而免疫組化技術(shù)是檢測(cè)這種表 達(dá)紊亂程度的唯一可靠手段。因此提供一種檢測(cè)EHD2基因的表達(dá)產(chǎn)物在癌細(xì)胞內(nèi)部不同 位置特別是核中的表達(dá)情況的方法為現(xiàn)有技術(shù)中需要解決的問題。
[0014] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)手段和方案：
[0015] 一種對(duì)人EHD2蛋白特異的抗體，其特征是所述抗體能特異性識(shí)別人EHD2蛋白，所 述識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸序列為：503-SEQ ID N0:l-543。
[0016] 基因 EHD2及其編碼蛋白在乳腺癌免疫組織化學(xué)法診斷和預(yù)后預(yù)判中的應(yīng)用，所 述基因 EHD2的GeneBank國際通用序列編號(hào)為：NM_014601，所述基因 EHD2編碼蛋白的 GeneBank國際通用序列編號(hào)為：NP_055416。
[0017] 所述基因 EHD2及其編碼蛋白在乳腺癌免疫組織化學(xué)法診斷和預(yù)后預(yù)判中的應(yīng) 用，其特征是采用了前述抗體。
[0018] 基因 EHD2及其編碼蛋白在制備乳腺癌免疫組織化學(xué)法診斷和預(yù)后預(yù)判試劑中的 應(yīng)用，所述基因 EHD2的GeneBank國際通用序列編號(hào)為：NM_014601。
[0019] 所述基因 EHD2及其編碼蛋白在制備乳腺癌免疫組織化學(xué)法診斷和預(yù)后預(yù)判試劑 中的應(yīng)用，其特征是采用了前述抗體。
[0020] 一種多肽，其特征是所述多肽氨基酸序列為SEQ ID NO :1，。
[0021] 所述多肽，優(yōu)選以前述多肽氨基酸序列為核心序列對(duì)其進(jìn)行修飾，所述修飾為在 多肽N端連接一個(gè)半胱氨酸。
[0022] 所述多肽在制備前述抗體中的應(yīng)用。所述應(yīng)用優(yōu)選為作為抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫以 制備EHD2抗體。
[0023] 所述多肽在制備對(duì)EHD2特異的抗體中的應(yīng)用。所述應(yīng)用優(yōu)選為對(duì)抗體進(jìn)行抗原 純化。
[0024] -種用于乳腺癌診斷和預(yù)后判斷免疫組化試劑，其特征是采用前述對(duì)人EHD2蛋 白特異的抗體作為一抗或核心抗體。
[0025] 本發(fā)明說明書中所采用的術(shù)語：
[0026] "基因 EHD2的編碼蛋白"即"EHD2蛋白"。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，當(dāng)說明書中 提及"EHD2的表達(dá)"時(shí)，即是指"基因 EHD2及其編碼蛋白的表達(dá)"。
[0027] "核心序列"為人EHD2蛋白（genebank蛋白號(hào)NP_055416)的第503至543位氨基 酸序列，該核心序列對(duì)應(yīng)的多肽片段在化學(xué)合成后或重組表達(dá)后經(jīng)或不經(jīng)修飾可用于免疫 以產(chǎn)生對(duì)EHD2特異的抗體。
[0028] "修飾"為對(duì)上述核心序列對(duì)應(yīng)的多肽片段用化學(xué)方法或重組DNA等常規(guī)方法進(jìn)行 添加氨基酸、偶聯(lián)化學(xué)基團(tuán)或純化介質(zhì)，目的是用于免疫產(chǎn)生抗體或?qū)贵w進(jìn)行抗原純化。
[0029] 我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，基因