[0187] 2.BiW,BremanA,ShawCA,StankiewiczP,GambinT,etal. (2012)Detection of>/= 1Mbmicrodeletionsandmicroduplicationsinasinglecellusingcustom oligonucleotidearrays.PrenatDiagn, 32 ： 10-20
[0188] 3.ZhengYM，etal. (2011)Wholegenomeamplificationinpreimplantation geneticdiagnosis.JZUS, 12(1) 1-11.
[0189] 4.SpitsC,etal. (2006)Whole-genomemultipledisplacementamplification fromsinglecells.NATURE，1(4) 1965-1970
[0190] 5.SenthilkumarA，etal. (2014)Genome-widekaryomappingaccurately identifiestheinheritanceofsingle-genedefectsinhumanpreimplantation embryosinvitro.GeneticsinMedicine,doi：10.1038/gim. 2014. 45.
[0191] 6.FiorentinoF，etal. (2014)Developmentandvalidationofa next-generationsequencing-basedprotocolfor24-chromosomeaneuploidy screeningofembryos.FertilSteril，101 (5) ：1375-82.
[0192] 7.PukazhendhiGl，etal. (2014)Circulatingtumorcellsinbreastcancer. JCarcinog,doi：10.4103/1477-3163.
[0193] 8.CastleJ，etal. (2014)Thesignificanceofcirculatingtumourcellsin breastcancer：Areview.Breast,doi：10. 1016/i.breast. 2014. 07. 002.
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于構(gòu)建單細(xì)胞DNA測序文庫的方法，其特征在于，包括： 裂解細(xì)胞，釋放基因組DNA ; 將基因組DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增； 將預(yù)擴(kuò)增之后的基因組DNA進(jìn)行二次擴(kuò)增，以獲得所述單細(xì)胞DNA測序文庫。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將基因組DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和二次擴(kuò)增 的酶為一種或多種熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶，選自LA-Taq、rTaq、Phusion、Deep Vent、Deep Vent(exo-)、Gold 360、Platinum Taq 和 KAPA 2G Robust。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將基因組DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增的引物由三部分 組成，從DNA 5'端開始，第一部分為通用區(qū)域，此區(qū)域在不同測序平臺中序列不同；第二部 分為簡并堿基區(qū)域，該區(qū)域只包含兩種不互補(bǔ)的堿基，A和C，或A和G，或T和C，或T和G ; 第三部分為隨機(jī)簡并堿基區(qū)域，其中每個(gè)堿基可以是A、T、C、或G。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，第一部分通用區(qū)域的長度為1-70個(gè)堿基， 優(yōu)選10-50個(gè)堿基，更優(yōu)選10-30個(gè)堿基。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，第二部分簡并堿基區(qū)域的長度為2-20個(gè) 堿基，優(yōu)選5-15個(gè)堿基，更優(yōu)選5-10個(gè)堿基。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，第三部分隨機(jī)簡并堿基區(qū)域的長度為1-8 個(gè)堿基，優(yōu)選2-6個(gè)堿基，更優(yōu)選為3或者4個(gè)堿基。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，第三部分隨機(jī)簡并堿基區(qū)域中最后三個(gè) 隨機(jī)簡并堿基之間含有兩個(gè)硫代修飾。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，該預(yù)擴(kuò)增的引物序列為 5' GCTCTTCCGATCTRRRRRRRRRRN*N*N 3' 5' GCTCTTCCGATCTMMMMMMMMMMN##N 3' 5' GCTCTTCCGATCTYYYYYYYYYYN*N*N 3'或 5' GCTCTTCCGATCTKKKKKKKKKKN*N*N 3' 其中R代表A或G堿基，M代表A或C堿基，Y代表C或T堿基，K代表G或T堿基，N 代表隨機(jī)簡并堿基A/T/C/G，*代表硫代修飾。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將基因組DNA進(jìn)行二次擴(kuò)增的引物由兩部 分組成，從DNA 5'端開始，第一部分為外延伸區(qū)，該區(qū)域含有和上機(jī)測序通用雜交引物相結(jié) 合的區(qū)域，第二部分為引物匹配區(qū)，該區(qū)域含有和預(yù)擴(kuò)增引物雜交區(qū)域。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，二次擴(kuò)增引物外延伸區(qū)含有barcode序 列，用以區(qū)分不同的樣本或者給樣本引入特殊的特征標(biāo)記。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述barcode序列由ATCG四種堿基隨 意組合，堿基長度不固定。12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用于構(gòu)建單細(xì)胞DNA測序文庫的細(xì)胞為 單細(xì)胞或多細(xì)胞。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用于裂解細(xì)胞的酶為Proteinase K，或 者Protease,或者二者的組合。14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用于構(gòu)建單細(xì)胞DNA測序文庫的起始材 料為DNA。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，用于構(gòu)建單細(xì)胞DNA測序文庫的起始材 料DNA為基因組DNA、線粒體DNA、PCR產(chǎn)物或染色質(zhì)免疫共沉淀DNA。16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用于構(gòu)建單細(xì)胞DNA測序文庫的起始材 料為RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。17. 用于構(gòu)建單細(xì)胞DNA測序文庫的試劑盒，其特征在于，包含： 將單細(xì)胞進(jìn)行裂解的裂解緩沖液和裂解酶； 進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增的引物、緩沖液和DNA聚合酶；和 進(jìn)行二次擴(kuò)增的引物、緩沖液和DNA聚合酶。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，將基因組DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和二次擴(kuò) 增的酶為一種或多種熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶，選自LA_Taq、rTaq、Phusion、Deep Vent、Deep Vent(exo-)、Gold 360、Platinum Taq 和 KAPA 2G Robust。19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，將基因組DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增的引物由 三部分組成，從DNA 5'端開始，第一部分為通用區(qū)域，此區(qū)域在不同測序平臺中序列不同； 第二部分為簡并堿基區(qū)域，該區(qū)域只包含兩種不互補(bǔ)的堿基，A和C，或A和G，或T和C，或 T和G ;第三部分為隨機(jī)簡并堿基區(qū)域，其中每個(gè)堿基可以是A、T、C、或G。20. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，第一部分通用區(qū)域的長度為1-70個(gè) 堿基，優(yōu)選10-50個(gè)堿基，更優(yōu)選10-30個(gè)堿基。21. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，第二部分簡并堿基區(qū)域的長度為 2-20個(gè)堿基，優(yōu)選5-15個(gè)堿基，更優(yōu)選5-10個(gè)堿基。22. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，第三部分隨機(jī)簡并堿基區(qū)域的長度 為1-8個(gè)堿基，優(yōu)選2-6個(gè)堿基，更優(yōu)選為3或者4個(gè)堿基。23. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，第三部分隨機(jī)簡并堿基區(qū)域中最后 三個(gè)隨機(jī)簡并堿基之間含有兩個(gè)硫代修飾。24. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，該預(yù)擴(kuò)增的引物序列為 5' GCTCTTCCGATCTRRRRRRRRRRN*N*N 3' 5' GCTCTTCCGATCTMMMMMMMMMMN##N 3' 5' GCTCTTCCGATCTYYYYYYYYYYN*N*N 3'或 5' GCTCTTCCGATCTKKKKKKKKKKN*N*N 3' 其中R代表A或G堿基，M代表A或C堿基，Y代表C或T堿基，K代表G或T堿基，N 代表隨機(jī)簡并堿基A/T/C/G，*代表硫代修飾。25. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，將基因組DNA進(jìn)行二次擴(kuò)增的引物由 兩部分組成，從DNA 5'端開始，第一部分為外延伸區(qū)，該區(qū)域含有和上機(jī)測序通用雜交引物 相結(jié)合的區(qū)域，第二部分為引物匹配區(qū)，該區(qū)域含有和預(yù)擴(kuò)增引物雜交區(qū)域。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的試劑盒，其特征在于，二次擴(kuò)增引物外延伸區(qū)含有barcode 序列，用以區(qū)分不同的樣本或者給樣本引入特殊的特征標(biāo)記。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的試劑盒，其特征在于，所述barcode序列由ATCG四種堿基 隨意組合，堿基長度不固定。28. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，用于構(gòu)建單細(xì)胞DNA測序文庫的細(xì)胞 為單細(xì)胞或多細(xì)胞。29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的試劑盒，其特征在于，用于裂解細(xì)胞的酶為Proteinase K， 或者Protease,或者二者的組合。30. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，用于構(gòu)建單細(xì)胞DNA測序文庫的起始 材料為DNA。31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其特征在于，用于構(gòu)建單細(xì)胞DNA測序文庫的起始 材料DNA為基因組DNA、線粒體DNA、PCR產(chǎn)物或染色質(zhì)免疫共沉淀DNA。32. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于，用于構(gòu)建單細(xì)胞DNA測序文庫的起始 材料為RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。33. -種引物序列，從DNA 5'端開始，包括：第一部分的通用區(qū)域，此區(qū)域在不同測序 平臺中序列不同；第二部分的簡并堿基區(qū)域，該區(qū)域只包含兩種不互補(bǔ)的堿基，A和C，或A 和G，或T和C，或T和G ;第三部分的隨機(jī)簡并堿基區(qū)域，其中每個(gè)堿基可以是A、T、C、或G。34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的引物，其特征在于，第一部分通用區(qū)域的長度為1-70個(gè)堿 基，優(yōu)選10-50個(gè)堿基，更優(yōu)選10-30個(gè)堿基。35. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的引物，其特征在于，第二部分簡并堿基區(qū)域的長度為2-20 個(gè)堿基，優(yōu)選5-15個(gè)堿基，更優(yōu)選5-10個(gè)堿基。36. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的引物，其特征在于，第三部分隨機(jī)簡并堿基區(qū)域的長度為 1-8個(gè)堿基，優(yōu)選2-6個(gè)堿基，更優(yōu)選為3或者4個(gè)堿基。37. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的引物，其特征在于，第三部分隨機(jī)簡并堿基區(qū)域中最后三 個(gè)隨機(jī)簡并堿基之間含有兩個(gè)硫代修飾。38. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的引物，其特征在于，該引物序列為 5' GCTCTTCCGATCTRRRRRRRRRRN*N*N 3' 5' GCTCTTCCGATCTMMMMMMMMMMN##N 3' 5' GCTCTTCCGATCTYYYYYYYYYYN*N*N 3' 或 5' GCTCTTCCGATCTKKKKKKKKKKN*N*N 3' 其中R代表A或G堿基，M代表A或C堿基，Y代表C或T堿基，K代表G或T堿基，N 代表隨機(jī)簡并堿基A/T/C/G，*代表硫代修飾。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于構(gòu)建單細(xì)胞DNA測序文庫的方法和試劑盒，更具體的，本發(fā)明涉及用于構(gòu)建高通量測序的單細(xì)胞DNA測序文庫的方法和試劑盒。
【IPC分類】C40B50/06, C12N15/11
【公開號】CN104963000
【申請?zhí)枴緾N201410773064
【發(fā)明人】石燕濱, 吳凱, 王文璐, 張建光
【申請人】北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2014年12月15日