快速低成本制備DNA Ladder的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其是一種快速低成本制備DNA Ladder的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA ladder是一組已知大小和濃度的DNA片段混合樣品，可以與未知的DNA樣品一起進(jìn)行凝膠電泳用于初略指示其分子量與濃度，是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用的試劑耗材之
O
早期的DNA ladder是使用限制性內(nèi)切酶(如ECOR I或者Hind ΠΙ等)酶切λ噬菌體的基因組DNA或猴病毒細(xì)菌的質(zhì)粒DNA片段而獲得大小不同的DNA片段。這種方法的人力、物力以及儀器維護(hù)成本特別高，并且產(chǎn)生DNA片段的大小常常受到限制性酶切位點(diǎn)的限制，不能人工調(diào)控DNA ladder的片段大小和濃度。
PCR能夠快速有效地獲得大量目標(biāo)片段，并且在合適的范圍(100bp-3000bp)內(nèi)可通過引物設(shè)計(jì)高效廉價(jià)的獲取任意大小的片段，通過將含有目標(biāo)大小片段構(gòu)建到PMD18-T載體上，利用載體上的通用引物分別對(duì)每個(gè)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA ladder的每一個(gè)DNA片段再按照設(shè)計(jì)好濃度進(jìn)行稀釋與混合，最終快速廉價(jià)的制備大小、濃度均可控的DNA ladder。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種快速低成本制備DNA Ladder的方法，它解決了傳統(tǒng)酶切方法成本高、獲得DNA片段大小與濃度不可控制的難題，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:快速低成本制備DNA Ladder的方法，根據(jù)DNA Ladder所需要的條帶大小，從已知基因組序列中選取目標(biāo)大小的DNA序列，采用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR進(jìn)行擴(kuò)增，切膠回收后將不同大小的條帶分別構(gòu)建到PMD18-T載體，并提取質(zhì)粒，獲得各個(gè)片段的模板；測(cè)定各純化后的目的片段的濃度，按照設(shè)計(jì)好的濃度進(jìn)行混合與稀釋，得到最終DNA ladder。
將每個(gè)DNA片段的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化具體是:利用pMDlS-Τ載體上的通用引物M13F與M13R，分別對(duì)每一個(gè)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過脫鹽純化PCR產(chǎn)物，獲得各目的片段，利用10 X TE緩沖液溶解，，可以長(zhǎng)期保存。
PCR能夠快速有效地獲得大量目標(biāo)片段，并且在合適的范圍(100bp-3000bp)內(nèi)可通過引物設(shè)計(jì)高效廉價(jià)的獲取任意大小的片段，
由于采用了以上技術(shù)方案，本發(fā)明通過PCR擴(kuò)增的方法獲得DNA Ladder所需要的條帶，所有條帶的大小和濃度都可以精確控制，不受傳統(tǒng)方法(如EcoR I酶切λ DNA)受酶切位點(diǎn)和質(zhì)粒濃度的限制，生產(chǎn)成本能降低90% ;再通過將含有目標(biāo)大小片段構(gòu)建到pMD18-T載體上，利用載體上的通用引物分別對(duì)每個(gè)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA ladder的每一個(gè)DNA片段再按照設(shè)計(jì)好濃度進(jìn)行稀釋與混合，最終快速廉價(jià)的制備大小、濃度均可控的DNAladder。解決了傳統(tǒng)酶切方法成本高、獲得DNA片段大小與濃度不可控制的難題。而采用本發(fā)明方法制造的DNA ladder清晰度與指示效果與商用DNA ladder基本相當(dāng)，可以代替商用DNA ladder使用。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，易于實(shí)施，成本低廉，使用效果好。
【附圖說明】，
圖1為本發(fā)明的流程示意圖；
圖2為本發(fā)明的制備DNA ladder與商用DNA ladder的對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】，
本發(fā)明的實(shí)施例:快速低成本制備DNA Ladder的方法步驟一、TlOO?T3000模板的克隆與構(gòu)建
在Tair數(shù)據(jù)庫中檢索挑選合適長(zhǎng)度的DNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以擬南芥幼嫩花cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從擬南芥基因組中克隆3000bp、2000bp、1500 bpUOOO bp,750 bp、500 bp,300 bp、100bp 的 DNA 片段，引物組合依次為(DLF+3000R，DLF+2000R，DLF+1000R，DLF+750R，DLF+500R，DLF+300R，DLF+100R)其對(duì)應(yīng)擴(kuò)增引物序列見序列表，并分別構(gòu)建到PMD8-T載體，分別命名為T-100?T3000 ;挑選出陽性克隆，并用質(zhì)粒提取試劑盒(上海生工)制備陽性質(zhì)粒，具體操作參考示意圖1，序列信息見序列表。
步驟二、T100?T3000快速擴(kuò)增與純化
采用pMD8-T載體上公用引物M13F和M13R分別對(duì)T100?T3000的進(jìn)行擴(kuò)增，采用氯仿乙醇純化方法進(jìn)行脫鹽處理，用10XTE buffer溶解，獲得濃度大、純度高可以長(zhǎng)期保存的各個(gè)DNA目的片段。
(1)配置PCR反應(yīng)混合物(上海生工2X Taq PCR反應(yīng)試劑盒):
2 X Taq PCR Mixture10 μ I
正向引物 Μ13 F (10μΜ ) I μ I 反向引物 Μ13 R (10μΜ) I μ I 質(zhì)粒 DNA (lOng/μ I) 2 μ I dd H2O6 μ I
每個(gè)不同大小的DNA片段分別配制10份。
(2)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)的時(shí)間和溫度如下:
94°C 3min
94°C 30s，
58°C 30s?3min (根據(jù)目標(biāo)片段長(zhǎng)度，I Kb/min)
72°C 30s，40cycles72 °C 5min
(3)純化與溶解:
分別將每個(gè)DNA片段的擴(kuò)增產(chǎn)物收集到一起，加入200 μ I氯仿(國藥)，劇烈振蕩30s，室溫放置5min，12000g，4°C，離心lOmin，取上清至新管中，加入500 μ I無水乙醇，混勾后-20°C放置 20min，12000g，4°C，離心 lOmin，去上清，加入 Iml 75% 乙醇，10000g，5min，4°C，離心 lOmin，去上清，空氣干燥 15min，加 50 μ I 10 X TE buffer 50_60°C溶解 5min ;取I μ I稀釋10倍，測(cè)定濃度備用。
步驟三、DNA ladder的混合與檢測(cè)
按照DNA ladder所需要的濃度，用10XTE buffer稀釋混合每一個(gè)DNA片段；加入溴酚藍(lán)使終濃度為lg/L ;取5 μ I與商用DNA ladder 一起電泳，如圖2所示，采用本發(fā)明制備的DNA ladder與商用DNA ladder效果相當(dāng)。
本發(fā)明所述并不限于【具體實(shí)施方式】中所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案得出其他的實(shí)施方式，同樣屬于本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新范圍。顯然本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)范圍內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速低成本制備DNA Ladder的方法，其特征在于:根據(jù)DNA Ladder所需要的條帶大小，從已知基因組序列中選取目標(biāo)大小的DNA序列，采用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR進(jìn)行擴(kuò)增，切膠回收后將不同大小的條帶分別構(gòu)建到PMD18-T載體，并提取質(zhì)粒，獲得各個(gè)片段的模板；采用載體上公用引物大量擴(kuò)增獲得個(gè)目的片段，測(cè)定其濃度，按照設(shè)計(jì)好的濃度進(jìn)行混合與稀釋，得到最終DNA ladder。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速低成本制備DNALadder的方法，其特征在于:將每個(gè)DNA片段的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化具體是:利用pMD18-T載體上的通用引物M13F與M13R，分別對(duì)每一個(gè)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過脫鹽純化PCR產(chǎn)物，獲得各目的片段，利用10 X TE緩沖液溶解。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種快速低成本制備DNA Ladder的方法。本發(fā)明通過PCR擴(kuò)增的方法獲得DNA Ladder所需要的條帶，所有條帶的大小和濃度都可以精確控制，不受傳統(tǒng)方法（如EcoR I 酶切λ DNA）受酶切位點(diǎn)和質(zhì)粒濃度的限制，生產(chǎn)成本能降低90%；再通過將含有目標(biāo)大小片段構(gòu)建到pMD18-T載體上，利用載體上的通用引物分別對(duì)每個(gè)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA ladder的每一個(gè)DNA片段再按照設(shè)計(jì)好濃度進(jìn)行稀釋與混合，最終快速廉價(jià)的制備大小、濃度均可控的DNA ladder。解決了傳統(tǒng)酶切方法成本高、獲得DNA片段大小與濃度不可控制的難題。而采用本發(fā)明方法制造的DNA ladder清晰度與指示效果與商用DNA ladder基本相當(dāng)，可以代替商用DNA ladder使用。
【IPC分類】C12N15/10, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN104988134
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510265744
【發(fā)明人】李小冬, 于二汝, 舒健虹, 王小利, 莫本田, 蔡一鳴, 吳佳海
【申請(qǐng)人】貴州省草業(yè)研究所
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年5月24日