植物調(diào)控元件及其用圖
【專(zhuān)利說(shuō)明】植物調(diào)控元件及其用途
[oocn] 相關(guān)申請(qǐng)的引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2012年12月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/739, 720的權(quán)益， 所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)W引用方式整體并入本文中。
[000引序列表的并入
[0004] 包含在文件名為"M0NS323W0seq.txt"的文件中的序列表在此W電子遞送方式提 交并且W引用方式并入本文中，所述文件為345?。ò凑誐icrosoftWindows⑩中所測(cè) 得）并且于2013年12月17日創(chuàng)建。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明設(shè)及植物分子生物學(xué)、植物遺傳工程W及可用于調(diào)節(jié)植物中基因表達(dá)的 DNA分子的領(lǐng)域。
[000引發(fā)明背景
[0007] 調(diào)控元件是通過(guò)調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄DNA分子的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控基因活性的 遺傳元件。該樣的元件包括啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子、內(nèi)含子和3'非翻譯區(qū)，并且可用于 植物分子生物學(xué)和植物遺傳工程的領(lǐng)域中。
[000引發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明提供用于植物中的新穎基因調(diào)控元件和包含所述調(diào)控元件的構(gòu)建體。本發(fā) 明還提供包含所述調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物、植物部分和種子。在一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供本文所公開(kāi)的可操作地連接至可轉(zhuǎn)錄DNA分子的調(diào)控元件。在某些實(shí)施方 案中，可轉(zhuǎn)錄DNA分子相對(duì)于本文所提供的調(diào)控元件序列是異源的。本文還提供制備和使 用本文所公開(kāi)的調(diào)控元件、包含所述調(diào)控元件的構(gòu)建體W及轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、植物部 分和種子的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、植物部分和種子包含可操作地連接至相對(duì)于 所述調(diào)控元件為異源的可轉(zhuǎn)錄DNA分子的調(diào)控元件。
[0010] 因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含DNA序列的重組DNA分子，所述DNA序列選自 由W下組成的組；a)與SEQIDNO: 1-98和168-171中任一個(gè)具有至少約85%序列同一性的 DNA序列；b)包含SEQIDNO: 1-98 和 168-171 中任一個(gè)的DNA序列；和C)SEQIDNO: 1-98 和168-171中任一個(gè)的片段，其中所述片段具有基因調(diào)控活性；其中所述DNA序列可操作 地連接至異源可轉(zhuǎn)錄DNA分子。"異源可轉(zhuǎn)錄DNA分子"意指可轉(zhuǎn)錄DNA分子相對(duì)于DNA 序列是異源的。在特定實(shí)施方案中，重組DNA分子包含與SEQIDNO: 1-98和168-171中任 一個(gè)的DNA序列具有至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少約95%、 至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的DNA序列。在具體實(shí)施方案中， 異源可轉(zhuǎn)錄DNA分子包含農(nóng)學(xué)目的基因，例如能夠在植物中賦予除草劑抗性或抗蟲(chóng)性的基 因。在另外其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含如本文所提供的重組DNA分子的構(gòu)建體。
[0011] 在另一方面，本文提供包含重組DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述重組DNA分子包 含選自由W下組成的組的DNA序列；a)與SEQIDNO: 1-98和168-171中任一個(gè)具有至少 約85%序列同一性的DNA序列；b)包含SEQIDNO: 1-98和168-171中任一個(gè)的DNA序列； 和c)SEQIDN0:l-98和168-171中任一個(gè)的片段，其中所述片段具有基因調(diào)控活性；其中 所述DNA序列可操作地連接至異源可轉(zhuǎn)錄DNA分子。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞 是單子葉植物細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞。
[0012] 在又一方面，本文進(jìn)一步提供包含重組DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物或其部分，所述重 組DNA分子包含選自由W下組成的組的DNA序列；a)與SEQIDNO: 1-98和168-171中任 一個(gè)具有至少約85%序列同一性的DNA序列；b)包含SEQIDNO: 1-98和168-171中任一 個(gè)的DNA序列；和c)SEQIDNO: 1-98和168-171中任一個(gè)的片段，其中所述片段具有基因 調(diào)控活性；其中所述DNA序列可操作地連接至異源可轉(zhuǎn)錄DNA分子。在特定實(shí)施方案中，轉(zhuǎn) 基因植物是相對(duì)于起始轉(zhuǎn)基因植物，任一代的子代植物，并且包含重組DNA分子。本發(fā)明還 提供包含重組DNA分子的轉(zhuǎn)基因種子，其在生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因植物。
[0013] 在又一方面，本發(fā)明提供通過(guò)W下方式在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)可轉(zhuǎn)錄DNA分子（例 如農(nóng)學(xué)目的基因）的方法：獲得含有本發(fā)明的重組DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物并且栽培所述植 物。
[0014] 本文還提供了通過(guò)W下方式提供轉(zhuǎn)基因植物的方法：用本發(fā)明的重組DNA分子轉(zhuǎn) 化植物細(xì)胞W產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞并且使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生W產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
[0015] 附圖簡(jiǎn)述
[0016] 圖1;顯示對(duì)應(yīng)于來(lái)自云草（Agrostisnebulosa)的啟動(dòng)子元件的各種大小的 多個(gè)啟動(dòng)子變體的比對(duì)。具體地說(shuō)，圖1顯示包含在調(diào)控表達(dá)元件組巧XP化XP-AG化e. 化ql:l:7(SEQIDN0:1)中的 2005 堿基對(duì)化P)啟動(dòng)子P-AG化e.化ql-l:l:5(SEQID N0:2)與P-AGRne.Ubql-l:l:5 的啟動(dòng)子變體的比對(duì)。例如P-AGRne.Ubql-l:l:5 的 5,端 的缺失產(chǎn)生啟動(dòng)子P-AG化e.化ql-l:l:4(SEQIDN0:6)，所述啟動(dòng)子是包含在EXP-AG化e. 化ql:l:8(SEQIDN0:5)中的999bp序列。示于圖1中的另一啟動(dòng)子變體是P-AG化e. 化ql-l:l:6(SEQIDN0:8)，其為包含在EXP-AG化e.化ql:l:9(SEQIDN0:7)中的 762bp序 列。
[0017] 圖2;顯示對(duì)應(yīng)于來(lái)自蘆竹（Arundodonax)的啟動(dòng)子元件的各種大小的多個(gè)啟動(dòng) 子變體的比對(duì)。具體地說(shuō)，圖2顯示包含在調(diào)控表達(dá)元件組EXP-ARUdo.化ql: 1:4(SEQID N0:9)中的 4114bp啟動(dòng)子P-ARUdo.化ql-l:l:4(SEQIDN0:10)與P-ARUdo.化ql-l:l:4 的啟動(dòng)子變體的比對(duì)。所述比對(duì)中包括2012bp啟動(dòng)子P-ARUdo.化ql-l:l:5(SEQID N0:14) ;1000bp啟動(dòng)子P-ARUdo.Ubql-1:1:6(SEQIDN0:17);和 75化p啟動(dòng)子P-ARUdo. 化ql-l:l:8(SEQIDN0:22)。
[0018] 圖3;顯示對(duì)應(yīng)于來(lái)自蘆竹的啟動(dòng)子元件的各種大小的多個(gè)啟動(dòng)子變體的 比對(duì)。具體地說(shuō)，圖3顯示2033bp啟動(dòng)子P-ARUdo.化q2-l: 1:4(SEQIDN0:24)與 P-ARUdo.化q2-l: 1:4的啟動(dòng)子變體的比對(duì)。所述比對(duì)中包括2004bp啟動(dòng)子P-ARUdo. 化q2-l:l:6(SEQIDN0:28) ;100化口啟動(dòng)子P-ARUdo.化q2-l:l:5(沈QIDN0:31);和69化P 啟動(dòng)子P-ARUdo.化q2-l:l:7(SEQIDN0:33)。
[0019] 圖4;顯示對(duì)應(yīng)于來(lái)自格蘭馬草炬outeloua gracilis)的啟動(dòng)子元件的各種大小 的多個(gè)啟動(dòng)子變體的比對(duì)。具體地說(shuō)，圖4顯示237化P啟動(dòng)子P-B0U gr.化ql-l:l:2(SEQ ID N0:35)與P-BOUgr.化ql-l:l:2的5'端的啟動(dòng)子變體的比對(duì)。所述比對(duì)中包括1999bp 啟動(dòng)子P-BOUgr.化ql-l:l:3(SEQ ID N0:39) ;1022bp啟動(dòng)子P-BOUgr.化ql-l:l:5(SEQ ID N0:42);和 760bp啟動(dòng)子P-BOUgr.化ql-l:l:6(SEQIDN0:44)。
[0020] 圖5 ;顯示對(duì)應(yīng)于來(lái)自格蘭馬草的啟動(dòng)子元件的各種大小的多個(gè)啟動(dòng)子變體的 比對(duì)。具體地說(shuō)，圖5顯示2100bp啟動(dòng)子元件P-BOUgr.化q2-l:l:4(SEQIDN0:46)與 P-BOUgr.化q2-l: 1:4的啟動(dòng)子變體的比對(duì)。所述比對(duì)中包括2043bp啟動(dòng)子P-BOUgr. 化q2-l:l:7(SEQIDN0:50) ;2002bp啟動(dòng)子P-BOUgr.化q2-l:l:5(SEQIDN0:53) ;1024bp 啟動(dòng)子P-BOUgr.化q2-l:l:6(SEQIDN0:56);和 749bp啟動(dòng)子P-BOUgr.化q2-l:l:8(SEQ IDN0:61)。
[0021] 圖6;顯示對(duì)應(yīng)于來(lái)自中國(guó)芒（Miscanthussinesis)的啟動(dòng)子元件的各種大小的 多個(gè)啟動(dòng)子變體的比對(duì)。具體地說(shuō)，圖6顯示5359bp啟動(dòng)子元件P-MISsi.化ql-1:1:2(SEQ IDN0:63)與P-MISsi.化ql-l:l:2的啟動(dòng)子變體的比對(duì)。所述比對(duì)中包括2423bp啟動(dòng) 子P-MISsi.化 沈QIDN0:67);1447bp啟動(dòng)子P-MISsi.化ql-l:l:10(沈QID N0:71) ;899bp啟動(dòng)子P-MISsi.化ql-l:l:13(SEQIDN0:73) ;69化p啟動(dòng)子P-MISsi. 化ql-l:l:14(SEQIDN0:75);和 506bp啟動(dòng)子P-MISsi.化ql-l:l:9(SEQIDN0:77)。 [002引 圖7 ;顯示對(duì)應(yīng)于來(lái)自裂釋草（Schizachyiumscoparium)的啟動(dòng)子元件的各 種大小的多個(gè)啟動(dòng)子變體的比對(duì)。具體地說(shuō)，圖7顯示283化P啟動(dòng)子元件P-SCHsc. 化ql-l:l:12(SEQIDN0:79)與P-SCHsc.化的啟動(dòng)子變體的比對(duì)。所述比對(duì) 中包括 2033bp啟動(dòng)子P-SCHsc.化ql-1:1:11(SEQIDNO: 83) ; 1046bp啟動(dòng)子P-SCHsc. 化ql-l:l:10(沈QIDN0:85);和 547bp啟動(dòng)子P-SCHsc.化ql-l:l:14(沈QIDN0:87)。
[0023] 圖8;顯示對(duì)應(yīng)于來(lái)自黃假高梁（Sor曲astrumnutans)的啟動(dòng)子元件的各 種大小的多個(gè)啟動(dòng)子變體的比對(duì)。具體地說(shuō)，圖8顯示2218bp啟動(dòng)子元件P-S(?nu. 化ql-l:l:4(SEQIDN0:89)與P-S0化U.化ql-l:l:4的啟動(dòng)子變體的比對(duì)。所述比對(duì) 中包括 1964bp啟動(dòng)子P-S0化U.化ql-1:1:5(SEQIDNO: 93) ; 1023bp啟動(dòng)子P-S0化U. 化ql-l:l:6(SEQIDN0:96);和 724bp啟動(dòng)子P-S0化U.化ql-l:l:7(SEQIDN0:98)。
[0024] 圖9 ;顯示本發(fā)明的表達(dá)盒構(gòu)型。
[00幼序列簡(jiǎn)述
[0026] 沈QIDN0:1、5、7、9、13、16、18、19、21、23、27、30、32、：M、38、41、43、45、49、52、55、 58、60、62、66、70、72、74、76、78、82、84、86、88、92、95、97、99、103、106、108、110、114、116、 118、120、122、126、128、132、134、138、140、144、148、150和168是包含可操作地5'連接至 前導(dǎo)序列的啟動(dòng)子序列的調(diào)控表達(dá)元件組巧X巧的DNA序列，所述前導(dǎo)序列可操作地5'連 接至內(nèi)含子序列。
[0027] 沈QIDN0:2、6、8、10、14、17、22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、 63、67、71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、96、98、100、104、107、109、111、117、119、121、 123、129、135、141、145、151 和 169 是啟動(dòng)子序列。
[0028] 沈Q ID側(cè)：3、11、25、36、47、64、68、80、90、101、112、124、130、136、142、146、152和 170是前導(dǎo)序列。
[0029] 沈QIDN0:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、57、59、65、69、81、91、94、102、 105、113、115、125、127、131、133、137、139、143、147、149、153 和 171 是內(nèi)含子序列。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031] 本發(fā)明提供植物中具有基因調(diào)控活性的DNA分子。該些DNA分子的核巧酸序列是 WSEQIDNO: 1-98和168-171提供的。該些DM分子例如能夠影響植物組織中可操作地 連接的可轉(zhuǎn)錄DNA分子的表達(dá)，并且因此調(diào)控轉(zhuǎn)基因植物中可操作地連接的轉(zhuǎn)基因的基因 表達(dá)。本發(fā)明還提供修飾、產(chǎn)生和使用該些DNA分子的方法。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的 重組DNA分子的組合物（包括轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物、植物部分和種子）W及制備和使用該 些的方法。
[0032] 提供W下定義和方法來(lái)更好地限定本發(fā)明W及在本發(fā)明的實(shí)施中指導(dǎo)本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員。除非另外指出，否則術(shù)語(yǔ)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)使用方式來(lái)理 解。
[0033]DNA分子
[0034] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"DNA"或"DNA分子"是指細(xì)胞或合成來(lái)源的雙鏈DNA分 子，即，脫氧核糖核巧酸堿基的聚合物。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"DNA序列"是指DNA分子 的核巧酸序列。本文中所用的命名按美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)扣nitedStatesCodeofFederal Regulations) § 1. 822第37款所規(guī)定的，并且在WIPO標(biāo)準(zhǔn)ST. 25 (1998)，附錄2、表1和3 的表格中有所闡述。
[00巧]如本文所用的，"重組DNA分子"是包含在沒(méi)有人干預(yù)的情況下不會(huì)一起天然發(fā)生 的DNA分子組合的DNA分子。例如，重組DNA分子可W是包含至少兩個(gè)相對(duì)于彼此異源的 DNA分子的DNA分子、包含源于天然存在的DNA序列的DNA序列的DNA分子、或已通過(guò)遺傳 轉(zhuǎn)化并入宿主細(xì)胞的DNA中的DNA分子。
[0036] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"序列同一性"是指兩個(gè)最佳比對(duì)的DNA序列相同的程度。通 過(guò)人工比對(duì)兩個(gè)DNA序列（例如參考序列和另一DNA序列）來(lái)產(chǎn)生最佳序列比對(duì)，W最大 化具有適當(dāng)?shù)膬?nèi)部核巧酸插入、缺失或空位的序列比對(duì)中核巧酸匹配的數(shù)目。如本文所用 的，術(shù)語(yǔ)"參考序列"是指WSEQIDNO: 1-98和168-171提供的DNA序列。
[0037] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"序列同一性百分比"或"同一性百分比"或"同一性％ "是同 一性分?jǐn)?shù)乘W100。對(duì)于與參考序列最佳比對(duì)的DNA序列，"同一性分?jǐn)?shù)"是最佳比對(duì)中核巧 酸匹配的數(shù)目除W參考序列中的核巧酸總數(shù)，例如，整個(gè)參考序列的全長(zhǎng)中的核巧酸總數(shù)。 因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供包含與參考序列（本文中WSEQIDNO: 1-98和168-171 提供）最佳比對(duì)時(shí)，與參考序列具有至少約85%同一性、至少約86%同一性、至少約87%同 一'f生、至少約88%同一'f生、至少約89%同一'f生、至少約90%同一'f生、至少約91 %同一'f生、至 少約92%同一性、至少約93%同一性、至少約94%同一性、至少約95%同一性、至少約96% 同一'f生、至少約97%同一'f生、至少約98%同一'f生、至少約99%同一'f生或至少約100%同一'f生 的DNA序列的DNA分子。
[00測(cè) 調(diào)控元件
[003引調(diào)控元件（例如啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子、內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)（或3'UTR))是 活細(xì)胞中基因的總體表達(dá)的有機(jī)部分。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"調(diào)控元件"是指具有基因調(diào)控 活性的DNA分子。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"基因調(diào)控活性"是指例如通過(guò)影響可操作地連接的 可轉(zhuǎn)錄DNA分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯來(lái)影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄DNA分子的表達(dá)的能力。 因此，在植物中起作用的調(diào)控元件（例如啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子和內(nèi)含子）可用于通過(guò) 遺傳工程來(lái)改變植物表型。
[0040] 如本文所用的，"調(diào)控表達(dá)元件組"或"EXP"序列可W指一組可操作地連接的調(diào) 控元件，例如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列和內(nèi)含子。因此，調(diào)控表達(dá)元件組可w由例如可操作 地5'連接至前導(dǎo)序列的啟動(dòng)子組成，所述前導(dǎo)序列進(jìn)而可操作地5'連接至內(nèi)含子序列。
[0041] 調(diào)控元件可W通過(guò)W下來(lái)表征：其基因表達(dá)模式，例如，正和/或負(fù)效應(yīng)，例如組 成型表達(dá)、或時(shí)間、空間、發(fā)育、組織、環(huán)境、生理、病理、細(xì)胞周期和/或化學(xué)響應(yīng)性表達(dá)及 其任何組合，W及定量或定性指標(biāo)。如本文所用的，"基因表達(dá)模式"是可操作地連接的 DNA分子轉(zhuǎn)錄成轉(zhuǎn)錄的RNA分子的任何模式。轉(zhuǎn)錄的RNA分子可W翻譯而產(chǎn)生蛋白質(zhì)分 子或可W提供反義或其它調(diào)控RNA分子，例如雙鏈RNA(dsRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、核糖體 RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)等。
[0042] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)表達(dá)"是轉(zhuǎn)錄的RNA分子翻譯成蛋白質(zhì)分子的任何模 式。蛋白質(zhì)表達(dá)可W通過(guò)其時(shí)間、空間、發(fā)育或形態(tài)學(xué)性質(zhì)W及通過(guò)定量或定性指標(biāo)來(lái)表 征。
[0043]啟動(dòng)子可用作用于調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄DNA分子的表達(dá)的調(diào)控元件。如 本文所用的，術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"通常是指參與RNA聚合酶II和其它蛋白質(zhì)（例如反式作用轉(zhuǎn) 錄因子）的識(shí)別和結(jié)合W起始轉(zhuǎn)錄的DNA分子。啟動(dòng)子可W來(lái)源于基因的5'非翻譯區(qū) (5'UTR)。或者，啟動(dòng)子可W是合成產(chǎn)生或操作的DNA分子。啟動(dòng)子還可W是嵌合的。嵌 合啟動(dòng)子是通過(guò)兩個(gè)或更多個(gè)異源DNA分子的融合產(chǎn)生的?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的啟動(dòng)子 包括沈QIDN0:2、6、8、10、14、17、22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、63、67、 71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、96、98和169，包括其片段或變體。在本發(fā)明的特定實(shí)施 方案中，如本文所述的該些DM分子和其任何變體或衍生物進(jìn)一步被定義為包含啟動(dòng)子活 性，即，能夠在宿主細(xì)胞中（例如，在轉(zhuǎn)基因植物中）充當(dāng)啟動(dòng)子。在再一特定實(shí)施方案中， 可W將片段定義為展現(xiàn)出其所來(lái)源的起始啟動(dòng)子具有的啟動(dòng)子活性，或片段可W包含"最 小啟動(dòng)子"，所述"最小啟動(dòng)子"提供基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平，并且包含TATA框或用于RNA聚合酶II 復(fù)合物的識(shí)別和結(jié)合W實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始的等同DM序列。
[0044] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供如本文所公開(kāi)的啟動(dòng)子序列的片段。啟動(dòng)子片段可W包 含如上所述的啟動(dòng)子活