一種增強ctl免疫反應(yīng)的dc細(xì)胞培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞制備領(lǐng)域，具體為一種增強CTL免疫反應(yīng)的DC細(xì)胞培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]CTL:又稱細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte, CTL):是白細(xì)胞的亞群，為一種特異CD8+T細(xì)胞，專門分泌各種細(xì)胞因子參與免疫作用。對某些病毒、腫瘤細(xì)胞等抗原物質(zhì)具有殺傷作用，與自然殺傷細(xì)胞構(gòu)成機體抗病毒、抗腫瘤免疫的重要防線。有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)的核心是產(chǎn)生以CD8+T細(xì)胞為主體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，這也是DC作為免疫治療手段的基礎(chǔ)。
[0003]蛋白質(zhì)泛素化修飾:是泛素?蛋白酶體系統(tǒng)降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的主要步驟，通過由泛素激活酶(ubiquitin ?activating enzyme, El, UbelL)、泛素結(jié)合酶(ubiquitinconjugating enzyme, E2)和泛素連接酶(ubiquitin ligase, E3)等一系列酶活動將泛素連接到特定蛋白質(zhì)分子上，然后連接泛素的蛋白質(zhì)被蛋白酶體降解或發(fā)生功能改變。
[0004]泛素化在蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能、調(diào)節(jié)和降解中都起著十分重要的作用。同時，它也參與了細(xì)胞周期、增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳遞、損傷修復(fù)、炎癥免疫等幾乎一切生命活動的調(diào)控。
[0005]DC 細(xì)胞:又稱樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DC)，1973 年，Steiman 和 Cohn首次從脾臟中分離出一類與粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞形態(tài)和功都不同的白細(xì)胞，因其細(xì)胞膜向外伸出，形成與神經(jīng)細(xì)胞軸突相似的膜性樹狀突起，故而命名為樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs) 0 DCs是機體免疫反應(yīng)的始動者，能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，是唯一能活化靜息T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞，是啟動、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。未成熟DC具有較強的迀移能力，成熟DC能有效激活初始型T細(xì)胞，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。DC與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，大部分實體瘤內(nèi)浸潤的DC數(shù)量多則患者預(yù)后好。
[0006]DC抗腫瘤的機制如下:①DC可以高表達(dá)MHC?I類和MHC?II類分子，MHC分子與其捕獲加工的腫瘤抗原結(jié)合，形成肽?MHC分子復(fù)合物，并遞呈給T細(xì)胞，從而啟動MHC?I類限制性CTL反應(yīng)和MHC?II類限制性的⑶4+Thl反應(yīng)。同時，DC還通過其高表達(dá)的共刺激分子(⑶80/B7?1、⑶86/B7?2、⑶40等)提供T細(xì)胞活化所必須的第二信號，啟動了免疫應(yīng)答。②DC與T細(xì)胞結(jié)合可大量分泌IL?12、IL?18激活T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)CTL生成，主導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答，利于腫瘤清除；激活穿孔素P顆粒酶B和FasL/Fas介導(dǎo)的途徑增強NK細(xì)胞毒作用?、跠C分泌趨化因子(Chemotactic Cytokines，CCK)專一趨化初始型T細(xì)胞促進(jìn)T細(xì)胞聚集，增強了 T細(xì)胞的激發(fā)。保持效應(yīng)T細(xì)胞在腫瘤部位長期存在，可能通過釋放某些抗血管生成物質(zhì)(如IL?12、IFN?γ)及前血管生成因子而影響腫瘤血管的形成。上述CCK進(jìn)一步以正反饋旁分泌的方式活化DC，上調(diào)IL?12及⑶80、⑶86的表達(dá)；同時DC也直接向⑶8+Τ細(xì)胞呈遞抗原肽，在活化的⑶4+Τ細(xì)胞輔助下使⑶8+Τ細(xì)胞活化，⑶4+和⑶8+Τ細(xì)胞還可以進(jìn)一步通過分泌細(xì)胞因子或直接殺傷，增強機體抗腫瘤免疫應(yīng)答。
[0007]DC分布廣泛，但數(shù)量極微.它主要來源于骨髓系，也可由人外周血單核細(xì)胞在細(xì)胞因子誘導(dǎo)下直接分化形成成熟的樹突狀細(xì)胞。目前的經(jīng)典制備方法是:采集人體外周血，分離得到單個核細(xì)胞，在體外利用磁珠分選的方法分離出單核細(xì)胞，然后應(yīng)用各種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)7天后誘導(dǎo)生成DC，然后負(fù)載相應(yīng)的腫瘤抗原，制成負(fù)載腫瘤抗原的DC。再將這些DC細(xì)胞注入體內(nèi)后刺激體內(nèi)的腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞增殖，發(fā)揮長期腫瘤監(jiān)視作用和腫瘤殺傷作用，達(dá)到消滅腫瘤的目的。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)中⑶細(xì)胞的培養(yǎng)方法通常為:
[0009]I)、將采集的血液以密度梯度離心法分離，收集單個核細(xì)胞。
[0010]2)、細(xì)胞沉淀用含I %胎牛血清(FBS)的RPM1-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度3?4X 106/mL，于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中孵育2小時，棄去懸浮細(xì)胞。
[0011]3)、用含10% FBS的RPM1-1640培養(yǎng)基重懸貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為IX 106/mL，并加入終濃度為50?100ng/mL的細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4，于37°C ,5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。期間每隔3天半量換液，補充細(xì)胞因子。
[0012]4)、第七天加入 IL-1 β (10ng/mL)，IL-6 (10ng/mL)，TNF-a (lOng/mL)，PGE2 (I μ g/mL)，孵育24小時。
[0013]5)、第8天收獲成熟DC細(xì)胞。
[0014]但是這種方法使用含有胎牛血清的培養(yǎng)基，在人體可能會產(chǎn)生針對異種蛋白的過敏反應(yīng)，培養(yǎng)時間為8天，漫長的培養(yǎng)過程降低了 DC細(xì)胞的活性，增加了體外培養(yǎng)過程中細(xì)菌等微生物污染的機會，現(xiàn)有的促進(jìn)DC成熟的細(xì)胞因子，不能大量地誘導(dǎo)Thl-DC的產(chǎn)生，因此不能有效地促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞增殖，最終獲得的DC抗原攝取、加工和呈遞能力較低，只有15?20%，不能有效地激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的增殖和殺傷能力。因此，尋求一種有效的DC培養(yǎng)方法是提高免疫治療療效的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中獲得的DC周期長、攝取和呈遞腫瘤抗原的能力只有15?20%，不能有效地激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的增殖和殺傷能力的缺陷，提供一種有效的DC培養(yǎng)方法是提高免疫治療療效的方法。
[0016]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
[0017]一種增強CTL免疫反應(yīng)的DC細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下幾個步驟:
[0018]I)、米集血液，制備貼壁單核細(xì)胞；
[0019]2)、貼壁單核細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
[0020]用含I %人血白蛋白的無血清培養(yǎng)液重懸貼壁單核細(xì)胞，調(diào)整貼壁單核細(xì)胞的濃度為I?2 X loVmL,加入400?lOOOpFU/細(xì)胞量的UbelL sh-RNA慢病毒于37°C，5 %體積濃度的C02培養(yǎng)箱中孵育2小時后，更換新鮮的I %人血白蛋白的無血清培養(yǎng)液，并加入終濃度為50?100ng/mL的細(xì)胞因子GM-CSF和15?50ng/ml的細(xì)胞因子IL-4，于37°C，5%體積濃度的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測；
[0021]培養(yǎng)第72h，半量補充新鮮的1%人血白蛋白的無血清培養(yǎng)液和終濃度為50?100ng/mL的細(xì)胞因子GM-CSF和15?50ng/ml的細(xì)胞因子IL-4，并加入促熟細(xì)胞因子組合，于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中孵育16?24小時；
[0022]培養(yǎng)第96h，收集成熟DC細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞染色和流式檢測和Western blotting方法檢測蛋白質(zhì)ISGylat1n表達(dá)水平。
[0023]進(jìn)一步的，所述步驟2)中的促熟細(xì)胞因子組合的添加量為10?20 μ g/mLpoly (IC)，5 ?10 μ g/mL LPS, 500 ?1000IU/mL IFN ?γ，10 ?20ng/mL TNF ?α。
[0024]進(jìn)一步的，采集血液，制備貼壁單核細(xì)胞的方法為:
[0025]I)、將新鮮采集的血液收集在含肝素鈉抗凝劑的采血袋中，搖勻；
[0026]2)、將血液以等體積生理鹽水稀釋混勻，按照稀釋后的血液與淋巴細(xì)胞分離液的體積比為3:2，將稀釋后的血液緩慢疊加于離心管中的淋巴細(xì)胞分離液之上，注意保持液層分界清晰；
[0027]3)、在20°C下900g離心25min，離心結(jié)束后，吸取單個核細(xì)胞層液體，移入新的離心管中；
[0028]4)、以5倍于3)中收集到的單個核細(xì)胞層液體積的生理鹽水稀釋單個核細(xì)胞層液，在4°C下400g離心5min ；
[0029]5)重復(fù)步驟4)兩次，去除上清液；
[0030]6)、用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2?3X 106/mL，于37°C，5%體積濃度的C02培養(yǎng)箱中孵育I小時，棄去懸浮細(xì)胞，獲得貼壁的單核細(xì)胞。
[0031]本發(fā)