一種培養(yǎng)裂殖壺菌高產(chǎn)dha的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及DHA的生產(chǎn)，具體涉及一種培養(yǎng)裂殖壺菌高產(chǎn) DHA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 二十二碳六稀酸（22:6n_3, docosahexaenoic acid, DHA)是一種重要的 ω-3 系列 多不飽和脂肪酸（co-3polyunsaturated fatty acids)，其既能夠促進嬰幼兒智力和視力 發(fā)育，又具有預防老年人心血管疾病、抗癌、抗炎、增強免疫力等功效。傳統(tǒng)的提取多不飽和 脂肪酸的方法是從深海魚油獲取，隨著環(huán)境污染以及海洋漁業(yè)資源的逐漸匱乏，從深海魚 中提取不飽和脂肪酸顯露出存諸多問題，例如品質(zhì)不穩(wěn)定、外源性污染、氣味不良、純化成 本高等，魚油中含有的EPA和膽固醇也使其不適于添加入孕嬰食品中。相反，隨著微生物發(fā) 酵技術(shù)的不斷成熟，以及微生物發(fā)酵油脂技術(shù)的深入研究，從微生物中獲取油脂不但容易 實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，而且還可以克服了傳統(tǒng)魚油普遍存在受地域和氣候條件制約的問題，應 用前景非常廣闊。
[0003] 裂殖壺菌（Schizochytrium)是目前工業(yè)化生產(chǎn)DHA的理想物種之一，其屬于破囊 壺菌科的一類海洋微藻，通過高密度發(fā)酵培養(yǎng)，其體內(nèi)可積累大量脂肪，且70%以甘油三酯 形式存在，其中DHA可以占到總脂肪酸的45~55%。
[0004] 裂殖壺菌屬于異養(yǎng)型微生物，葡萄糖、果糖和甘油是裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的良 好碳源，其中葡萄糖為最適碳源。傳統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)藻油DHA主要用葡萄糖作為碳源，但是生 產(chǎn)1噸DHA油脂大約需要消耗5噸葡萄糖，這種轉(zhuǎn)化是低效率的，加之生產(chǎn)過程中需輸入大 量能量，設備投資與維護費用不菲，使得當前藻油DHA的生產(chǎn)成本非常高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種培養(yǎng)裂殖壺菌高產(chǎn)DHA 的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007] -種培養(yǎng)裂殖壺菌高產(chǎn)DHA的方法，包括如下步驟：
[0008] (1)將裂殖壺菌菌種接種至裝有培養(yǎng)基的搖瓶中，于25~35°C搖床中以150~ 250rpm轉(zhuǎn)速進行恒溫恒轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20~35h。
[0009] (2)將步驟（1)得到的種子液轉(zhuǎn)接到裝有培養(yǎng)基的搖瓶中，接種體積為培養(yǎng)基裝 液量的5~10%，于25~30°C、150~250rpm條件下進行恒溫恒轉(zhuǎn)速培養(yǎng)16~20h，測 量所得種子液的細胞干重，若得到的種子液中細胞干重達到18~22g/L，則直接進行步驟 ⑷。
[0010] (3)若步驟⑵得到的種子液中細胞干重沒達到18~22g/L，則將其進一步轉(zhuǎn)接 到裝有培養(yǎng)基的搖瓶中，按照步驟（2)中的方法進行培養(yǎng)；重復該步驟一次或多次至培養(yǎng) 得到的種子液中細胞干重達到18~22g/L。
[0011] (4)將上述細胞干重達到18~22g/L的種子液以5~10% (V/V)的接種量接種 到裝有培養(yǎng)基的種子罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)；通過氨水或液堿控制發(fā)酵過程PH值維持在5. 5~ 6. 5之間，培養(yǎng)溫度控制在25~35°C，通氣量控制在0. 3~0. 5vvm，培養(yǎng)至發(fā)酵液中葡萄糖 耗盡，停止培養(yǎng)；
[0012] (5)將步驟（4)種子罐中的發(fā)酵液以5~10%的接種量接種到裝有培養(yǎng)基的發(fā) 酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度控制在22~33°C，通氣量控制在0. 3~0. 5vvm，通過流加 葡萄糖溶液控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度維持在30~50g/L，通過流加混合氮源溶液控制發(fā)酵 過程中總氮的濃度維持在15~25g/L，該混合氮源中包含酵母抽提物、玉米漿干粉、谷氨酸 鈉、蛋白胨中的一種或多種；通過流加氨水或液堿控制發(fā)酵過程pH維持在5. 5~6. 5 ;發(fā)酵 培養(yǎng)至70~IOOh后進行低溫脅迫培養(yǎng)，將溫度降低為18~22°C，其余條件不變，繼續(xù)培養(yǎng) 30 ~50h〇
[0013] 上述步驟（1)、（2)和（3)中的培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖40~50g/L、酵母抽提物 10~25g/L、硫酸鈉5. 0~10.0 g/L、氯化鉀0. 6~0. 8g/L、硫酸鎂1. 8~2. 2g/L、磷酸二 氫鉀1. 9~2. lg/L、氯化鈣0. 14~0. 16g/L、硫酸銨0. 8~I. 2g/L、四水氯化錳1. 68~ I. 72mg/L、七水硫酸鋅2. 8~3. Omg/L、五水硫酸銅L 4~I. 6mg/L、二水鉬酸鈉0~0· 05mg/ L、六水氯化鈷0~0· 05mg/L。
[0014] 上述步驟（4)和（5)中的培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖75. 0~85. Og/L、玉米漿干粉 15~20g/L、酵母抽提物2. 9~3. lg/L、谷氨酸鈉5. 0~15. Og/L、硫酸鈉5. 0~10.0 g/ U氯化鉀0. 6~0. 8g/L、硫酸鎂1. 8~2. 2g/L、磷酸二氫鉀1. 9~2. lg/L、氯化鈣0. 14~ 0· 16g/L、硫酸銨(λ 8~L 2g/L、四水氯化錳L 68~L 72mg/L、七水硫酸鋅2. 8~3. Omg/L、 五水硫酸銅1. 4~I. 6mg/L、二水鉬酸鈉0~0· 05mg/L、六水氯化鈷0~0· 05mg/L。
[0015] 步驟（1)中所述的裂殖壺菌菌種優(yōu)選為裂殖壺菌ATCC20888。更優(yōu)選的，步驟（1) 為：將用甘油保存的裂殖壺菌ATCC20888菌種接種到裝有50mL培養(yǎng)基的250m搖瓶中，于 25~30°C搖床中以150~250rpm轉(zhuǎn)速進行恒溫恒轉(zhuǎn)速培養(yǎng)25~35h。
[0016] 步驟⑷和（5)中所述的氨水的濃度優(yōu)選為28~30% (V/V)，所述的液堿的濃度 優(yōu)選為30~40% (W/V)。
[0017] 步驟（5)中所述的葡萄糖溶液的濃度優(yōu)選為700~750g/L，所述的混合氮源溶液 的濃度優(yōu)選為200~500g/L。
[0018] 步驟⑷中所述的種子罐的體積優(yōu)選為200L，罐體裝液量優(yōu)選為150L ;步驟（5) 中所述的發(fā)酵罐的體積優(yōu)選為3000L，罐體裝液量優(yōu)選為1500L。
[0019] 本發(fā)明通過對裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，釆用傳統(tǒng)的 好氧發(fā)酵法，在3000L發(fā)酵罐發(fā)酵前中期采用相對較高溫進行高密度培養(yǎng)，發(fā)酵后期進行 低溫脅迫培養(yǎng)，該培養(yǎng)方法既降低了發(fā)酵成本，又降低發(fā)酵過程的控制難度，發(fā)酵結(jié)束后發(fā) 酵液的細胞干重達到120~150g/L，DHA達到40~50g/L，比已見報道的DHA生產(chǎn)率高出 1. 2~1. 5倍，非常適合應用于DHA的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明培養(yǎng)裂殖壺菌高產(chǎn)DHA的方法具 有以下優(yōu)勢：
[0020] (1)采用前中期高溫培養(yǎng)，后期短時間的低溫脅迫誘導培養(yǎng)，與傳統(tǒng)的低溫發(fā)酵相 比，能耗至少降低30%，大大減少了發(fā)酵過程對能量的需求，以及對制冷設備的要求。
[0021] (2)本發(fā)明中所用培養(yǎng)基配方相比于傳統(tǒng)發(fā)酵，生產(chǎn)水平較高，并且成本大幅度降 低，能夠在增加收益的同時降低發(fā)酵風險。
[0022] (3)通過高密度好氧發(fā)酵法培養(yǎng)裂殖壺菌生產(chǎn)DHA等多不飽和脂肪酸（PuFA)可減 少因市場需求過大而導致的大量捕撈帶來的環(huán)境影響，因此該發(fā)明對環(huán)境資源的保護具有 潛在的意義，同時通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)二十二碳六烯酸等產(chǎn)品，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的三廢 較少，工廠的建設和投資成本相對較低。
[0023] (4)盡管目前發(fā)現(xiàn)的高密度培養(yǎng)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)的脂質(zhì)含量通常比傳統(tǒng)魚油 低，但微生物發(fā)酵生產(chǎn)的油脂含有大量必須脂肪酸，而且通過微生物發(fā)酵法獲得的脂肪酸 組成比較簡單，多不飽和脂肪酸的含量非常高，富集也比從傳統(tǒng)魚油提取容易得多，這種高 純度對后續(xù)提取工藝極為有利，能夠簡化提純過程，在工業(yè)生產(chǎn)中可以極大地降低生產(chǎn)成 本。
[0024] (5)通過微生物發(fā)酵法獲得多不飽和脂肪酸的工藝不受季節(jié)及氣候變化的因素 限制，可以全年進行生產(chǎn)，并且不受原料和產(chǎn)地的限制，增加了多不飽和脂肪酸生產(chǎn)的靈活 性。
[0025] (6)通過微生物發(fā)酵法提取得到的油脂不像魚油制品那樣含有較多的膽固醇，增 加了產(chǎn)品的純度及產(chǎn)品的適用面，使產(chǎn)品的品質(zhì)更有保證。
[0026] (7)高密度培養(yǎng)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA，其菌種裂殖壺菌富含蛋白質(zhì)、微量元素、 維生素、抗氧化劑等，在膳食配方中可以作為大量營養(yǎng)素和微量營養(yǎng)素的來源。
[0027] (8)通過微生物進行發(fā)酵的不僅可以提高產(chǎn)品的質(zhì)量，而且可以利用基因工程手 段并結(jié)合微生物產(chǎn)多不飽和脂肪酸的代謝途徑，利用代謝調(diào)控的方法來控制PuFA的組成， 從而可以實現(xiàn)產(chǎn)品生產(chǎn)的人工控制。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。 [0029] 實施例1
[0030] (1)配制培養(yǎng)基
[0031] 搖瓶培養(yǎng)基的配制方法如下：將配方中的組分四水氯化錳、七水硫酸鋅、五水硫酸 銅、二水鉬酸鈉、六水氯化鈷稱量后，用無菌水充分溶解，制備成母液，酸性條件下，121°C高 壓蒸汽滅菌20min ;其他成分稱量之后，用無菌水充分溶解后分裝至搖瓶，121°C高壓蒸汽 滅菌20min。
[0032] 搖瓶培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖45g/L、酵母抽提物10g/L、硫酸鈉8. Og/L、氯化鉀 0. 7g/L、硫酸鎂2. Og/L、磷酸二氫鉀2. Og/L、氯化鈣0. 15g/L、硫酸銨1.0 g/L、四水氯化錳 1. 7mg/L、七水硫酸鋅3. 0mg/L、五水硫酸銅I. 5mg