一種快速大量提取分離薏苡仁低聚糖單體的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物活性成分提取分離技術領域，具體涉及一種快速大量提取分離薏苡仁低聚糖單體的方法。
【背景技術】
[0002]隨著科學和公共衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，各種傳染病已基本得到有效控制，但各種慢性疾病依然占據(jù)人類疾病譜和死亡譜的前列。疾病模式的變化以及科學技術的發(fā)展引發(fā)人們對食品功能的理性認識，促使人類開始重新審視飲食與現(xiàn)代疾病的關系。因此，功能性食品日益受到人們的青睞。功能性低聚糖廣泛存在于生命體內，如在牛奶、蜂蜜、大麥、韭菜、洋蔥、大蒜、菊芋、香蕉和雪蓮果等天然動植物中均發(fā)現(xiàn)存在有功能性低聚糖，其能參與細胞間信息傳遞、細胞轉化等各種生理過程，具有重要的生物活性。同時，低聚糖常被作為功能性食品添加劑添加于飲料(果汁、咖啡、可可、茶、蘇打水和酒精性飲料)、牛奶制品(發(fā)酵乳、速溶奶粉和冰淇淋)、益生菌酸奶和益生元-益生菌的共生產(chǎn)品(膳食補充低聚糖選擇性地促進益生菌生長，與外源益生菌結合促進宿主生長和新陳代謝)，因而低聚糖產(chǎn)品的市場潛力巨大。在日本，低聚果糖已被認為是一種食品，已有500多種食品中含有低聚果糖成分。食用低聚果糖不僅能改善腸內益生菌群的狀況，減輕腹瀉、便秘的癥狀，改善糖尿病患者和高血脂患者的脂質水平，還能抑制腸內腐敗菌群的生長。由于其具有明確的化學結構以及促進人體腸道內有益菌增殖、防齲齒、降血脂等獨特的生理功效，功能性低聚糖備受國內外研究者的關注。
[0003]目前從天然產(chǎn)物中提取低聚糖的常用方法有:熱水恒溫回流提取、堿提酸沉法、醇析法、微波或超聲波輔助提取等。純物理的恒溫回流提取雖然具有較低的生產(chǎn)成本，但是由于操作時間長、提取率低等弊端，限制了其推廣運用；堿提酸沉不僅同樣存在提取時間較長、提取率不高等問題，而且其操作過程需要使用大量的化學試劑，容易造成環(huán)境污染。微波輔助提取時間短、產(chǎn)率高，但是由于微波具有邊角熱效應，容易造成受熱不均，影響提取率；且用于熱不穩(wěn)定性物質、非極性物質和高粘度物質提取時，也會影響提取效率，因此在利用微波輔助提取時需十分注意控制提取時間及功率。超聲-微波協(xié)同提取(UMAE)技術集微波、超聲波提取特點于一體，既可彌補超聲波和微波獨立提取的不足，又集中保留了兩種提取方法的優(yōu)點，突出體現(xiàn)在振動勻化，可使樣品介質內各點作用一致，且可降低目標物與樣品基體的結合力，加速目標物從固相進入溶劑相的過程。將UMAE技術運用于低聚糖的快速提取中，可實現(xiàn)大量低聚糖的提取。
[0004]低聚糖的定性和定量分析對其在生物醫(yī)學和功能性食品方面的表現(xiàn)有著重要的影響。如今，硅膠、活性炭、陰離子交換和凝膠層析技術等一系列的分離方法已被單獨或者組合運用于功能性食品領域，用于制備益生元。低聚糖的聚合度對益生菌利用率也具有重要的影響，其吸收能力一般隨分子量的減小而增大，同時對抗致病菌能力也有一定的影響，聚合度越低的低聚糖抗菌活性越強。不同聚合度低聚糖的分離已經(jīng)在上述分離方法中逐步實現(xiàn)。而與傳統(tǒng)柱層析法存在操作復雜、填料昂貴等問題相比，液相色譜法具有分辨率高、速度快、重復性高、色譜柱可反復使用、可自動化操作、分析精確度高等特點，能較為準確地鑒定產(chǎn)物和分離情況。閃式制備色譜技術，根據(jù)所施加的壓力可以分為快速色譜(0.1-5/10bars)或中壓制備色譜(MPLC，5/10-50 bars)。將閃式制備色譜結合蒸發(fā)光散射與親水色譜技術(MPLC-ELSD)運用于在線監(jiān)測低聚糖單體的分離，具有高自動化、高分辨率、高產(chǎn)量與安全性等優(yōu)點。
[0005]薏苡仁又稱薏米或薏仁，為禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁，原產(chǎn)于南亞，我國33° N以南的大部分地區(qū)都有種植，以福建、河北、遼寧、江蘇等地資源較豐富。薏苡仁為藥食兩用食品，除含有豐富的蛋白質、碳水化合物、脂肪、維生素以及礦物質外，還含有活性多糖、低聚糖、薏苡仁內酯、留類化合物、薏苡醇等多種生物活性物質。本發(fā)明以薏苡仁為材料，運用UMAE技術結合MPLC，建立了一種快速提取分離薏苡仁低聚糖單體的方法。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種快速大量提取分離薏苡仁低聚糖單體的方法，該方法運用超聲波-微波協(xié)同作用實現(xiàn)薏苡仁低聚糖的快速提取，并運用MPLC分離技術實現(xiàn)低聚糖單體的快速分離，其具有提取時間短、純化效率高的特點，可填補國內薏苡仁低聚糖高效提取分離技術的空白，有助于拓展薏米深加工的途徑，為薏苡仁低聚糖的開發(fā)利用提供基礎，提升薏苡仁產(chǎn)業(yè)價值，同時也可為其他天然低聚糖的高效提取分離技術提供新的方向。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種快速大量提取分離薏苡仁低聚糖單體的方法，其是以新鮮薏苡仁為原料，經(jīng)選料烘干、粉碎過篩、加水復配、水洗淀粉、超聲波-微波協(xié)同提取、真空抽濾、醇析、離心濃縮、冷凍干燥、MPLC分離、MPLC 二次分離的步驟，制得具有不同聚合度的薏苡仁低聚糖單體粉末。
[0008]該方法具體包括以下步驟:
1)選料烘干:選取顆粒飽滿、無病蟲害的新鮮薏苡仁，篩選去芯后放入鼓風干燥箱中，于50 °C烘至水分含量為8~10% ；
2)粉碎過篩:將干燥后的薏苡仁粉碎，過40目篩；
3)加水復配:取步驟2)所得薏苡仁粉末，按料液比1:3加入去離子水混勻進行復配；
4)水洗淀粉:將步驟3)所得復配料液過100目篩，再用薏苡仁粉末重量2~4倍的去離子水沖洗濾渣，然后合并濾液，于4°C條件下靜置沉淀8 h，離心去除淀粉沉淀，所得上清液與沖洗后的薏苡仁濾渣合并；
5)超聲波-微波協(xié)同提取:在步驟4)所得上清液與濾渣中加入無水乙醇，至溶液中乙醇的體積含量為30~40%，然后將溶液與濾渣移至150 mL異型玻璃三角瓶中，再放入超聲波-微波組合催化合成儀中進行提?。?br> 6)真空抽濾:提取結束后將提取液真空抽濾，棄去濾渣；
7)醇析:將步驟6)所得濾液于60~65°C下濃縮至原體積的1/5~1/4后加入濃縮液3倍體積、質量濃度為95%的乙醇，混勻后于4°C下靜置12 h ;
8)離心濃縮:將步驟7)所得溶液離心后去除沉淀，上清液于55~65°C下真空旋轉蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3~2/5 ;
9)冷凍干燥:將濃縮液冷凍干燥，得薏苡仁低聚糖粗糖粉末； 10)MPLC分離:將步驟9)所得薏苡仁低聚糖粗糖粉末溶于去離子水中，配制成濃度為0.4-0.6 g/mL的溶液，然后將溶液經(jīng)0.22 μ m的微孔濾膜過濾后注入MPLC進行分離，根據(jù)保留時間針對性地收集各目標化合物，收集液分別于65°C下真空旋轉蒸發(fā)回收溶劑后，經(jīng)冷凍干燥得含特定化合物的凍干粉末；
11)MPLC二次分離:取步驟10)所得含特定化合物的凍干粉末，分別按步驟10)的操作和色譜條件進行二次進樣，收集保留時間相同的各目標峰，經(jīng)溶劑回收、冷凍干燥即得不同聚合度的薏苡仁低聚糖單體粉末。
[0009]超聲波-微波協(xié)同提取的反應系統(tǒng)包括高精度接觸式溫度傳感器、微波發(fā)生器和超聲波發(fā)生器；其中，超聲波發(fā)生器的探頭直徑為Φ 18 _，探頭插入溶液的深度為1.2 cm,超聲波頻率為25 KHz ;微波頻率為2450 MHz。
[0010]所述超聲波-微波協(xié)同提取具體分三個階段進行:第一階段為超聲波間歇提取，超聲波功率為100~120 W，超聲波總處理時間為2.5~3.2 min，其中，處理10~12 s后停止15-20 S，如此循環(huán)；第二、三階段為微波-超聲波共同提取，其中，第二階段的微波功率為50-100 W、超聲功率為480~500 W，提取時間為220~250 S，第三階段的微波功率為280~300W、超聲功率為1000~1100 W，并于67~70°C下控溫輔助提取80~110 S。
[0011]MPLC的分離系統(tǒng)包括中壓特制玻璃柱(36X460 mm)、色譜栗、DAD紫外全波長掃描器(檢測波長范圍為190-840 nm)和FLASH ELSD蒸發(fā)光散射檢測器、自動餾分收集器和手動樣品加載模塊；
所述中壓特制玻璃柱為Claricep Flash HILIC親水柱，其填料粒徑為20-35 μπι，孔徑100Α，比表面320 m2/g，碳含量5.0% ；
所述FLASH ELSD蒸發(fā)光散射檢測器的檢測條件為:吹掃氮氣壓力為2.5-3.5 bar，漂移管溫度85~95°C。
[0012]MPLC分離中上樣體積為I mL，流動相為乙腈與水的二元混合體系，其流速為30~40mL/min，柱溫 25°C ；
流動相比例變化的具體程序為:乙腈比例為98~100%保持15 min,隨后將乙腈比例降至88~90%保持10 min,再降至7