一種伊蚊dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及物種鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列。
【背景技術(shù)】
[0002] 西表伊蚊，Aedes(Verrallina)iriomotensis(TanakaandMizusawa，1973)，屬雙 翅目（Diptera)、蚊科（Culicidae)、伊蚊屬（Aedes)、奇陽蚊亞屬（Verrallina)。伊蚊是蚊 科中最大一屬，近1000種，中國有1〇〇余種。伊蚊會(huì)傳播很多疾病，對(duì)人類的健康帶來了危 害，黃熱病與登革熱就主要通過伊蚊傳播。中國伊蚊中研究比較多的是埃及伊蚊和白紋伊 蚊。但目前對(duì)西表伊蚊的研究比較少，是否可能攜帶病毒及傳播疾病還知之甚少，有待進(jìn)一 步研究。
[0003] 對(duì)蚊蟲的鑒定和識(shí)別，是監(jiān)測和控制蚊媒傳染病的基礎(chǔ)，也是疾病預(yù)防與控制的 重要步驟。目前對(duì)蚊蟲的鑒定主要依靠經(jīng)驗(yàn)豐富的分類學(xué)家對(duì)蚊蟲的形態(tài)特征，但對(duì)近緣 種或形態(tài)殘缺標(biāo)本的鑒定十分困難。急需新的方法，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法的缺陷。
[0004] DNA條形碼技術(shù)（DNA Barcoding)是通過對(duì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分 析，從而快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)。近幾年來，DNA條形碼技術(shù)已被證明是一個(gè)行之 有效的生物鑒定手段，不僅可對(duì)傳統(tǒng)鑒定方法作強(qiáng)有力的補(bǔ)充，而且因?yàn)槠涓陀^、準(zhǔn)確， 突破以往對(duì)經(jīng)驗(yàn)的過度依賴，能幫助鑒定物種、發(fā)現(xiàn)新種和隱種、重建物種和高級(jí)階元的演 化關(guān)系等。
[0005] 作為DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)目的基因，一方面必須足夠保守，便于利用通用引物進(jìn) 行大范圍的擴(kuò)增；另一方面，要有足夠的變異來區(qū)分不同的物種。因此，鑒定不同的物 種類群需要選擇有效的目的基因。目前，在系統(tǒng)發(fā)育研究中廣泛應(yīng)用的標(biāo)志基因是核糖 體12S和16S基因，但因其存在大量的插入和缺失現(xiàn)象，不宜用作條形碼基因。線粒體 基因組中存在的13個(gè)蛋白編碼基因中僅細(xì)胞色素氧化酶亞基I (Cytochrome Oxidase Subunit I，C0 I )、線粒體細(xì)胞色素13化7吐）、勵(lì)4、勵(lì)5這4個(gè)基因滿足基因插入和缺失現(xiàn) 象較少、長度在900bp左右這兩個(gè)條件，但ND4、ND5進(jìn)化太快，不可能設(shè)計(jì)出通用引物，限制 了它們作為全面DNA鑒定系統(tǒng)的目標(biāo)基因。因此，人們最終選定CO I基因中的一個(gè)片段作 為DNA條形碼基因。迄今為止，已有諸多研究證明CO I基因在鳥類、魚類、鱗翅目昆蟲、蚊 類、蟻類和彈尾目等類群的分類鑒定中行之有效。因此，可以采用基于CO I基因的DNA條 形碼技術(shù)對(duì)蚊類進(jìn)行分子鑒定。該方法與傳統(tǒng)的分類方法互為佐證，不僅可解決鑒定中標(biāo) 本殘缺不全等問題，而且有利于實(shí)現(xiàn)蚊類的快速鑒定。目前，該方法在蚊類分子鑒定中的應(yīng) 用僅局限在少數(shù)蚊種，Genbank中也僅有少數(shù)蚊種的CO I基因序列，但至今尚無西表伊蚊 的相關(guān)基因序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明公開了一種西表伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基 因序列及其檢測和鑒定方法。
[0007] -種伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列，所述基因?yàn)槲鞅硪廖肅OI基因，其如序列表 SEQ ID NO. 1 所示：
[0008]
[0009] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括所述的伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列在檢測和鑒定西表伊 蚊中的應(yīng)用。
[0010] 進(jìn)一步地，所述應(yīng)用包括西表伊蚊的分子鑒定方法，包括以下步驟：
[0011] 1)從待測的組織中分離提取DNA ;
[0012] 2)以該DNA為模板，選擇相應(yīng)PCR引物，通過PCR擴(kuò)增待測組織的CO I基因；
[0013] 3)然后取適量步驟2)擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)染色后觀察，如果能特異性 擴(kuò)增出，600bp左右的條帶，則對(duì)其進(jìn)行測序；
[0014] 4)將測序結(jié)果與序列表SEQ ID NO. 1所示的伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列相比 較，如二者同源性在98%以上，即可判斷所述的待測組織即為西表伊蚊。
[0015] 本發(fā)明提供的西表伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列有利于實(shí)現(xiàn)西表伊蚊的快速鑒 定，縮短鑒定時(shí)間。本發(fā)明的鑒定方法填補(bǔ)了西表伊蚊分子鑒定領(lǐng)域的空白，相對(duì)傳統(tǒng)形態(tài) 學(xué)鑒定更高效便利，減少誤差，保證結(jié)果具有可靠性。
[0016] 為了更好地理解和實(shí)施，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明。
【附圖說明】
[0017] 圖1為西表伊文COI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜。其中，1號(hào)-11號(hào)：西表伊蚊； M:MarkerDLlOObp;12號(hào)：空白對(duì)照。
[0018] 圖2和圖3為待檢測組織PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜。其中，圖2 :1號(hào)-6號(hào)：待檢測組 織，M :Marker DLlOObp ;圖 3 :1 號(hào)：空白對(duì)照，2 號(hào)-6 號(hào)：待檢測組織，M :Marker DLlOObp。
【具體實(shí)施方式】
[0019]【實(shí)施例1西表伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因的確定】
[0020] 1、西表伊蚊標(biāo)本的采集與保存
[0021] 采集西表伊蚊，采獲的標(biāo)本經(jīng)冷凍處死后直接保存于75%酒精中。
[0022] 2、試驗(yàn)樣品的前處理
[0023] 取出保存于75%酒精中的西表伊蚊標(biāo)本，用解剖針將頭、生殖器部分和翅切下， 便于制片進(jìn)行種類鑒定。剩余部分移入PCR管中，75 %酒精保存，每管一只，并進(jìn)行唯一性 編號(hào)，用于DNA提取。若需較長時(shí)間保存，則應(yīng)將裝有西表伊蚊剩余組織部位的PCR管置 于-20°C冰箱凍存。
[0024] 3、DNA模板制備
[0025] 使用市售商品化基因組DNA提取試劑盒提取蚊蟲DNA。
[0026] 4、引物合成
[0027] 本實(shí)施例所用的引物如下：
[0028]正向引物：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
[0029]反向引物：GGTCAACAAATCATAAAGATAITGG
[0030] 5、PCR 擴(kuò)增
[0031] 本實(shí)施例的PCR反應(yīng)體系如下：
[0032]
[0033] 西表伊蚊PCR反應(yīng)程序：
[0034] %。(：預(yù)變性 3min ;35 個(gè)循環(huán)為 ％。(： 3〇sec、45°C 3〇sec、72°C，lmin ;72。(： 7min ; 4。。保
[0035] 存或進(jìn)行下一步
[0036] 6、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測
[0037] 取5ulPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130V電壓，電泳35min)。Goldview 染色。凝膠成像系統(tǒng)檢測，電泳圖譜參見附圖1。
[0038] 7、基因序列測定
[0039] 選取3-5個(gè)效果較好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送生物公司純化后測序（測序所用引物與 PCR所用引物相同），所得基因序列經(jīng)校正拼接后即為目的基因序列，獲得所述條形碼標(biāo)準(zhǔn) 檢測基因?yàn)镃O I基因，其序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
[0040]【實(shí)施例2利用條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測基因序列鑒定未知蚊蟲】
[0041] 1、未知蚊蟲標(biāo)本的采集與保存
[0042] 采集未知蚊蟲，采獲的標(biāo)本經(jīng)冷凍處死后直接保存于75%酒精中。
[0043] 2、試驗(yàn)樣品的前處理
[0044] 取出保存于75%酒精中的未知蚊蟲標(biāo)本，用解剖針將頭、生殖器部分和翅切下，便 于制片進(jìn)行種類鑒定。剩余部分移入PCR管中，75%酒精保存，每管一只，并進(jìn)行唯一性編 號(hào)，用于DNA提取。
[0045] 3、DNA模板制備
[0046] 使用市售商品化基因組DNA提取試劑盒提取蚊蟲DNA。
[0047] 4、引物合成
[0048] 本實(shí)施例所用的引物如下：
[0049]正向引物：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
[0050]反向引物：GGTCAACAAATCATAAAGATAITGG
[0051] 5、PCR 擴(kuò)增
[0052] 本實(shí)施例的PCR反應(yīng)體系如下：
[0053]
[0054]
[0055]PCR反應(yīng)程序：
[0056]95。(：預(yù)變性 3min ;35 個(gè)循環(huán)為 95°C 30sec、45°C 30sec、72°C，lmin ;72°C 7min; 4。。保
[0057]存或進(jìn)行下一步
[0058] 6、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測
[0059] 取5ulPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130V電壓，電泳35min)。Goldview 染色。凝膠成像系統(tǒng)檢測，電泳圖譜參見附圖2, 3,如圖所示，待檢測組織特異性擴(kuò)增產(chǎn)物均 為600bp左右。
[0060] 7、基因序列測定
[0061] 選取3-5個(gè)效果較好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送生物公司純化后測序（測序所用引物與 PCR所用引物相同），測試結(jié)果與西表伊蚊CO I基因序列（SEQ ID NO. 1)相比較，如果其同 源性大于98%，可以確認(rèn)該未知蚊蟲為西表伊蚊。
[0062] 本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施方式，如果對(duì)本發(fā)明的各種改動(dòng)或變形不脫離本發(fā)明 的精神和范圍，倘若這些改動(dòng)和變形屬于本發(fā)明的權(quán)利要求和等同技術(shù)范圍之內(nèi)，則本發(fā) 明也意圖包含這些改動(dòng)和變形。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列，其特征在于：所述基因?yàn)槲鞅硪廖肅O I基因， 其如序列表SEQ ID NO. 1所示： TTTTCGGAGT TTGATCAGGA ATAGTGGGAA CATCTCTAAG TATATTAATT CGTACAGAAT 60 TAAGTCACCC AGGAATATTC ATTGGAAATG ATCAAATTTA TAATGTAATT GTTACAGCTC 120 ATGCTTTTAT TATAATTTTC TTTATAGTAA TACCTATTAT AATTGGAGGA TTTGGAAATT 180 GATTAGTTCC TTTAATACTA GGAGCCCCAG ATATAGCTTT TCCTCGAATA AATAATATAA 240 GTTTTTGAAT ATTACCTCCT TCATTAACAC TCCTTTTATC TAGTTCAATA GTAGAAAATG 300 GAGCTGGAAC AGGATGAACT GTTTATCCAC CTTTATCTGC TGGAACTGCT CATGCAGGGA 360 GTTCAGTTGA TTTAGCAATT TTTTCTTTAC ATTTAGCTGG AATTTCTTCA ATTTTAGGTG 420 CAGTAAATTT TATTACTACA GTAATTAATA TACGGTCAGC AGGAATTACT CTTGATCGTC 480 TTCCTTTATT CGTGTGATCT GTTGTTATTA CAGCTATTCT TTTACTTCTT TCTCTTCCTG 540 TTTTAGCTGG AGCTATTACT ATATTATTAA CAGATCGAAA TTTAAATACT TCATTTTTTG 600 ATCCTATTGG AGGAGGAGAC CCAATTTTAT ATCAACATTT ATTTTGATTT TTTGGTCACC 660 GG 662〇2. 權(quán)利要求1所述的伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列在檢測和鑒定西表伊蚊中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用包括西表伊蚊的分子鑒定方法，包括以下步驟： 1) 從待測的組織中分離提取DNA ; 2) 以該DNA為模板，選擇相應(yīng)PCR引物，通過PCR擴(kuò)增待測組織的CO I基因； 3) 然后取適量步驟2)擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳分離，染色后觀察，如果能特異性擴(kuò)增 出，600bp左右的條帶，則對(duì)其進(jìn)行測序； 4) 將測序結(jié)果與序列表SEQ ID NO. 1所示的伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列相比較，如 二者同源性在98%以上，即可判斷所述的待測組織即為西表伊蚊。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列，其特征在于：所述基因?yàn)槲鞅硪廖肅O？Ⅰ基因，其序列如序列表SEQ？ID？NO.1所示。本發(fā)明的內(nèi)容還包括所述的伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列在檢測和鑒定西表伊蚊中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的西表伊蚊DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因序列有利于實(shí)現(xiàn)西表伊蚊的快速鑒定，縮短鑒定時(shí)間。本發(fā)明的鑒定方法填補(bǔ)了西表伊蚊分子鑒定領(lǐng)域的空白，相對(duì)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定更高效便利，減少誤差，保證結(jié)果具有可靠性。
【IPC分類】C12N15/53, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105039364
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510503896
【發(fā)明人】廉國勝, 柯明劍, 林加燕, 汪海波, 田綠波, 莫秋華, 楊澤, 馮子力, 蘇影, 李艷蘭
【申請(qǐng)人】珠海國際旅行衛(wèi)生保健中心
【公開日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年8月14日