一種錦鯉腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株錦鯉腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法及在分離病毒方面的應(yīng)用，屬于淡水生物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]錦鯉{Cyprinus carp1)又稱“緋鯉”、“日本錦鯉”是大型觀賞魚(yú)之一，是鯉魚(yú)的變種，屬鯉科，鯉屬，根據(jù)色彩、斑紋等分布情況，錦鯉又分為紅白、大正三色、昭和三色等13個(gè)品系。錦鯉因其體型好，顏色鮮艷，養(yǎng)殖規(guī)模越來(lái)越大。隨著養(yǎng)殖環(huán)境越來(lái)越惡劣，錦鯉的各種傳染性疾病尤其是錦鯉皰疹病毒病開(kāi)始廣泛傳播。錦鯉皰疹病毒病1998年首次爆發(fā)在以色列，但在1999年才確認(rèn)其真正病原是錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)。此后在英國(guó)、歐洲大陸、美國(guó)、日本也都有暴發(fā)。近年來(lái)，錦鯉皰疹病毒病的廣泛傳播，造成錦鯉養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已經(jīng)成為制約錦鯉養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。
[0003]流行病學(xué)研究表明，KHV傳播迅速，可感染任何年齡的錦鯉與鯉，感染KHV的病魚(yú)典型臨床癥狀是行動(dòng)遲緩、食欲不振、平衡失調(diào)、體表多黏液、在皮膚和鰭基部出現(xiàn)出血癥狀、眼球凹陷、鰓蒼白或顏色不規(guī)則并伴有中度至嚴(yán)重的鰓壞死，感染后7?1d開(kāi)始出現(xiàn)死亡，2?3周后死亡率可達(dá)100%。該病毒造成病魚(yú)的死亡率極高，疫情難以控制。
[0004]目前，從以色列、美國(guó)和日本3個(gè)地方分離出的KHV毒株的全基因組序列已被公布，來(lái)自以色列和美國(guó)的隔離群統(tǒng)稱為歐洲株，來(lái)自日本的KHV隔離群被命名為亞洲株。
[0005]病毒在細(xì)胞水平的分離與培養(yǎng)是研究錦鯉皰疹病毒病防控的基礎(chǔ)，是KHV最準(zhǔn)確的診療方法，但研究表明KHV只能在源自原始宿主細(xì)胞中生長(zhǎng)，因此，建立來(lái)源于錦鯉的細(xì)胞系，是進(jìn)行錦鯉皰疹病毒的分離與鑒定，研究其致病機(jī)理，疫苗制備和免疫預(yù)防技術(shù)的重要基礎(chǔ)。
[0006]在疫苗的研制上，以色列已經(jīng)研制出錦鯉皰疹病毒疫苗，并成功上市，由于不同基因型毒株存在差異，疫苗是否適用于中國(guó)錦鯉皰疹病毒病的防治也不得而知，因此，建立能夠分離目前KHV流行株的來(lái)源于錦鯉的細(xì)胞系迫在眉睫。
[0007]目前魚(yú)類細(xì)胞的原代培養(yǎng)技術(shù)基本可以分為兩種，組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。組織塊培養(yǎng)法容易產(chǎn)生機(jī)械損傷，細(xì)胞不易迀出，且迀出的細(xì)胞具有選擇性。消化法目前常用的是胰酶消化，但胰酶會(huì)對(duì)一些上皮細(xì)胞造成損傷，同時(shí)會(huì)對(duì)纖維和結(jié)締組織無(wú)效。迄今為止，通酶消化法制備錦鯉細(xì)胞系的文獻(xiàn)報(bào)道有:董傳甫、薛淑群和肖藝均采用組織塊分離法建立了錦鯉鰭條細(xì)胞系(Virus Research，2011，161: 140-149 ;水產(chǎn)學(xué)雜志，2012，25 (4):16-23 ;中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)2012，34(8): 767-774)，王英英采用消化法建立了一株錦鯉吻端細(xì)胞系(Aquaculture，2015，435:310 - 317)，但仍未見(jiàn)錦鯉腦來(lái)源細(xì)胞系的報(bào)道?？梢?jiàn)目前需要研究一種有效的錦鯉腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法，為后期建立錦鯉其他組織細(xì)胞系和進(jìn)行錦鯉皰疹病毒的研究奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種錦鯉腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法
本發(fā)明的目的在于提供上述方法構(gòu)建的錦鯉腦細(xì)胞系在錦鯉皰疹病毒培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種錦鯉腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法，該方法為:將錦鯉腦組織放入消化液A中進(jìn)行消化，收集細(xì)胞，再加入消化液B中進(jìn)行消化，收集消化后的細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)即可獲得錦鯉腦細(xì)胞系；
所述消化液A為含0.8?1.2g/L膠原酶和0.7?0.9g/L胰蛋白酶的D-Hanks溶液; 所述消化液B為含0.15?0.25g/L EDTA-4Na的D-Hanks溶液。
[0010]一種錦鯉腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
1)組織消化:將錦鯉腦組織放入消化液A中進(jìn)行消化，收集細(xì)胞，再加入消化液B中進(jìn)行消化，收集消化后的細(xì)胞；
2)原代培養(yǎng):將上步收集到的細(xì)胞加入錦鯉腦細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，在26?28°C,4.5?5.5% CO2條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)；
3)傳代培養(yǎng):當(dāng)原代培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底時(shí)，去培養(yǎng)液，用胰蛋白酶液消化，消化后去酶液，加入錦鯉腦細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將重懸細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
所述消化液A為含0.8?1.2g/L膠原酶和0.7?0.9g/L胰蛋白酶的D-Hanks溶液; 所述消化液B為含0.15?0.25g/L EDTA-4Na的D-Hanks溶液。
[0011]進(jìn)一步的，步驟I)中錦鯉腦組織為剪碎的無(wú)菌的錦鯉腦組織。
[0012]進(jìn)一步的，步驟I)中消化液A消化時(shí)的溫度為35?38 °C，消化時(shí)間為40?50min，每10?17min吹打一次。
[0013]進(jìn)一步的，步驟I)中消化液B消化的溫度為25?30°C，消化時(shí)間為2?5min。
[0014]進(jìn)一步的，在步驟I)原代培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞初次貼壁后，每隔2?3天換一次培養(yǎng)液。
[0015]進(jìn)一步的，上述錦鯉腦細(xì)胞培養(yǎng)液為含有14?16v/v%胎牛血清、9?llng/ml的表皮生長(zhǎng)因子、1.8?2.2ng/ml的堿性成纖維樣生長(zhǎng)因子、18?22mmol/LHEPES、適量青霉素、鏈霉素和兩性霉素B的L-15培養(yǎng)液，pH為7.0?7.4。
[0016]進(jìn)一步的，步驟3)中胰蛋白酶液中含有0.2?0.3%w/v胰酶-EDTA。
[0017]進(jìn)一步的，步驟3)中傳代培養(yǎng)至8?14代以后，用不含生長(zhǎng)因子，不含抗生素，且胎牛血清含量為9?llv/v%的錦鯉腦細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行后續(xù)的傳代培養(yǎng)。
[0018]上述方法制備的錦鯉腦細(xì)胞系在培養(yǎng)錦鯉皰疹病毒中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明的有益效果是:
I)本發(fā)明針對(duì)錦鯉腦組織細(xì)胞的特征，采用膠原酶和胰蛋白酶聯(lián)合消化法分離腦組織細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)，繼而成功構(gòu)建了錦鯉腦細(xì)胞系，已連續(xù)傳至100代以上，可提供大量的錦鯉腦來(lái)源細(xì)胞，且細(xì)胞能維持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，可以對(duì)其進(jìn)行冷凍保存。
[0020]2)本發(fā)明構(gòu)建的錦鯉腦細(xì)胞系可以連續(xù)傳代，經(jīng)這種方法傳代的錦鯉腦細(xì)胞系現(xiàn)已傳至100代，對(duì)錦鯉皰疹病毒(KHV)具有敏感性，接毒后均出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)，電鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)增殖的病毒粒子，本發(fā)明細(xì)胞系可以直接應(yīng)用于KHV病原特性研究及其疫苗的研制。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為相差顯微鏡下傳代培養(yǎng)的錦鯉腦細(xì)胞系的形態(tài)；A為錦鯉腦細(xì)胞原代；B為45代錦鯉腦細(xì)胞；
圖2為錦鯉腦細(xì)胞系在不同培養(yǎng)基下的生長(zhǎng)曲線；
圖3為錦鯉腦細(xì)胞系在不同血清濃度下的生長(zhǎng)曲線；
圖4為錦鯉腦細(xì)胞系在不同溫度下的生長(zhǎng)曲線；
圖5為錦鯉腦細(xì)胞系感染錦鯉皰疹病毒KHV圖片；A為感染KHV病毒之前的錦鯉腦細(xì)胞，B為感染KHV病毒72h后錦鯉腦細(xì)胞的CPE，C為感染KHV病毒120h后錦鯉腦細(xì)胞的CPE, D、E為感染KHV病毒的細(xì)胞電鏡切片圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]一種錦鯉腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法，該方法為:將錦鯉腦組織放入消化液A中進(jìn)行消化，收集細(xì)胞，再加入消化液B中進(jìn)行消化，收集消化后的細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)即可獲得錦鯉腦細(xì)胞系；
所述消化液A為含0.8?1.2g/L膠原酶和0.7?0.9g/L胰蛋白酶的D-Hanks溶液; 所述消化液B為含0.15?0.25g/L EDTA-4Na的D-Hanks溶液。
[0023]一種錦鯉腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
1)組織消化:將錦鯉腦組織放入消化液A中進(jìn)行消化，收集細(xì)胞，再加入消化液B中進(jìn)行消化，收集消化后的細(xì)胞；
2)原代培養(yǎng):將上步收集到的細(xì)胞加入錦鯉腦細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，在26?28°C,4.5?5.5% CO2條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)；
3)傳代培養(yǎng):當(dāng)原代培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底時(shí)，去培養(yǎng)液，用胰蛋白酶液消化，消化后去酶液，加入錦鯉腦細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將重懸細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
所述消化液A為含0.8?1.2g/L膠原酶和0.7?0.9g/L胰蛋白酶的D-Hanks溶液; 所述消化液B為含0.15?0.25g/L EDTA-4Na的D-Hanks溶液。
[0024]優(yōu)選的，步驟I)中錦鯉腦組織為剪碎的無(wú)菌的錦鯉腦組織。
[0025]優(yōu)選的，步驟I)中消化液A消化時(shí)的溫度為35?38°C，消化時(shí)間為40?50min，每10?17min吹打一次。
[0026]優(yōu)選的，步驟I)中消化液B消化的溫度為25?30°C，消化時(shí)間為2?5min。
[0027]優(yōu)選的，在步驟I)原代培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞初次貼壁后，每隔2?3天換一次培養(yǎng)液。
[0028]優(yōu)選的，上述錦鯉腦細(xì)胞培養(yǎng)液為含有14?16v/v%胎牛血清、9?llng/ml的表皮生長(zhǎng)因子、1.8?2.2ng/ml的堿性成纖維樣生長(zhǎng)因子、18?22mmol/LHEPES、適量青霉素、鏈霉素和兩性霉素B的L-15培養(yǎng)液，pH為7.0?7.4。
[0029]優(yōu)選的，步驟3 )中胰蛋白酶液中含有0.2?0.3%w/v胰酶-EDTA。
[0030]優(yōu)選的，步驟3)中傳代培養(yǎng)至8?14代以后，用不含生長(zhǎng)因子，不含抗生素，且胎牛血清含量為9?llv/v%的錦鯉腦細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行后續(xù)的傳代培養(yǎng)。
[0031 ] 上述方法制備的錦鯉腦細(xì)胞系在培養(yǎng)錦鯉皰疹病毒中的應(yīng)用。
[0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0033]實(shí)施例1鯉腦細(xì)胞系的構(gòu)建方法
(I)細(xì)胞培養(yǎng)液和組織消化液的配制
I.錦鯉腦細(xì)胞培養(yǎng)液的配制:
將L-15培養(yǎng)液(GIBCO)中加入15￥八％胎牛血清(GIBC0)，10ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子(EGF) (Sigma)和2ng/ml的堿性成纖維樣生長(zhǎng)因子(bFGF) (Sigma),同時(shí)添加100IU/ml青霉素、100 μ g/ml 鏈霉素、0.25 μ g/ml 兩性霉素 B，20mmol/L 的 HEPES, pH 為 7.0-7.4。
[0034]細(xì)胞傳至10代以后，將錦鯉腦細(xì)胞培養(yǎng)液中的胎牛血清添加量減至10%，不添加生長(zhǎng)因子和抗生素。
[0035]2.組織消化液的配制
專用組織消化液A:將10mg IV型膠原酶粉末和80