稻飛虱翅中總rna高效提取的方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領域，尤其涉及一種稻飛虱翅中總RNA高效提取的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 褐飛虱（NilaparvataIugens)、灰飛虱（Laodelphaxstriatellus)和白背飛虱 (Sogatellafurcifera)同屬于半翅目（Hemiptera)、飛風科（Delphacidae)，是目前亞洲 水稻上的重要害蟲。它的危害不僅能以成蟲和若蟲群集刺吸水稻韌皮部篩管汁液，影響水 稻生長發(fā)育，同時也是多種病毒病害傳播的媒介昆蟲。水稻南方黑條矮縮發(fā)病輕重就與帶 毒白背飛虱的迀入量有關(guān)。稻飛虱成蟲個體可分為長翅型與短翅型，其它昆蟲種類翅的分 化現(xiàn)象也很普遍?，F(xiàn)有的研究表明，昆蟲翅型的分化受多種因子的影響。目前已確定外界 環(huán)境條件與遺傳因子共同決定了昆蟲的翅型。因此飛虱翅中與翅型相對表達量有差異的相 關(guān)基因?qū)ρ芯匡w虱翅型分化具有重要的意義。
[0003] 欲對RNA進行研究，首先要從組織中提取得到高質(zhì)量的RNA。但RNA與DNA不同， 極容易發(fā)生降解，RNA降解將對后續(xù)研究的真實性及可靠性產(chǎn)生極大的影像。引起RNA降 解的主要因素是RNA酶。RNA酶有2種來源，一種是外源性的，一種是內(nèi)源性的。因此在采 集用于RNA提取的樣品時，重點就在于如何防止外源性RNA酶污染及抑制內(nèi)源性RNA酶活 性上。外源性RNA酶可以通過DEPC等RNA酶抑制劑處理實驗用品以及嚴格的實驗操作和 試驗環(huán)境的控制來加以排除。而內(nèi)源性RNA酶卻很難去除，只能通過液氮或干冰制造低溫 或者組織樣品保護液浸泡的方法來進行抑制。但對于某些組織來說，這樣的處理很難達到 預期效果，比如飛虱翅翼組織。
[0004] 由于飛虱翅質(zhì)地透明、纖薄，使用傳統(tǒng)液氮凍存后不方便研磨，且翅翼角質(zhì)化程度 高，使用樣品提取液無法快速滲透到組織內(nèi)部，起不到抑制RNA酶的效果。這些都是影響翅 總RNA提取量及質(zhì)量的重要因素，這些問題都阻礙了對翅中基因RNA水平表達研究的進展。 本發(fā)明就是為了解決以上難題而提供了一種從樣品收集開始，包括樣品分離、液滲透浸入， 到總RNA的高效提取的方法。
[0005]目前尚未見有飛虱翅中總RNA高效提取的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不能有效高效提取稻飛虱翅中總RNA的問 題，本發(fā)明提出了一種能夠獲得高質(zhì)量RNA，且不被外源或內(nèi)源RNA酶降解到最低限度，能 最大限度地保持被提取的總RNA的純度，以利于后續(xù)試驗的利用的稻飛虱翅中總RNA高效 提取的方法。
[0007] 技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：稻飛虱翅中總 RNA高效提取的方法，包括以下步驟：
[0008]a)實驗用具及耗材滅菌及RNA酶滅活處理：用0. 1 %DEPC水溶液浸泡實驗器材和 槍頭24h以上，部分耗材利用滅菌鍋高溫高壓濕熱滅菌處理，玻璃棒及石英砂等利用干燥 箱200°C干熱滅菌處理2h以上；工作臺面用RNA酶清除劑擦拭干凈；解剖針置于無水乙醇 中浸泡后用酒精燈進行灼燒滅活處理；
[0009]b)稻飛虱翅的分離：將稻飛虱成蟲利用無RNA酶水漂洗數(shù)次后，放入離心管中迅 速置于液氮罐中數(shù)十秒，使其迅速死亡，用滅菌后的解剖針迅速解離出稻飛虱翅部，避免殘 留翅根部肌肉組織帶入，裝入已加入300yLTrizol試劑的離心管中，并放置在冰上，收集 到長翅60頭以上，短翅120頭以上的稻飛虱翅翼后，將離心管置于-40°C保存24h;
[0010] C)總RNA的提?。?br>[0011] cl)在室溫下解凍步驟b得到的樣品，待樣品處于熔融狀態(tài)時利用高溫滅菌后的 玻璃棒沿著管壁研磨翅翼，待研磨難以進行時加入200目規(guī)格0.Olg石英砂助研磨，使翅脈 中內(nèi)容物充分釋放，研磨完畢再加入700yLTrizol試劑，混勻靜置2min;
[0012] c2)加入200yL氯仿，劇烈振蕩后室溫靜置；
[0013]c3)將上述混合物離心后獲得水相、蛋白相和氯仿相，取水相，加入與水相等體積 的異丙醇溶液，輕輕顛倒混勻后室溫下靜置IOmin;
[0014]c4)將步驟c3)中得到的混合物繼續(xù)離心后棄掉液體，保留管底微量白色固體；
[0015]c5)配制75%乙醇溶液：吸取無水乙醇750yL于一個新的無RNA酶離心管中，再 加入0. 1 %DEPC處理水250yL，顛倒搖勻，放置冰上冷卻；
[0016] c6)將ImL75%乙醇溶液加入步驟c4)得到的含有沉淀物的離心管中，劇烈振蕩， 使白色沉淀物懸浮在乙醇溶液中；
[0017] c7)重復以上步驟c4)_c6)，再進行兩次洗滌；
[0018]c8)小心棄掉離心管中上清液，用濾紙吸干離心管壁液體，將離心管放在超凈工作 臺中通風吹干，加入20yL無RNA酶水，用Nanodrop核酸定量儀測定濃度，分裝置于-70°C 超低溫冰箱備用，同時利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。
[0019] 更進一步的，所述步驟b)中稻飛虱用吸管吸取放入離心管中。
[0020] 更進一步的，所述步驟Cl)中解凍前采用低溫高速離心機-4°C進行預冷處理后再 置于室溫下解凍。
[0021] 更進一步的，所述步驟C2)中劇烈振蕩時間為15s，室溫靜置5min;
[0022] 更進一步的，所述步驟c3)中離心條件為12000g4°C離心15分鐘。
[0023] 更進一步的，所述步驟c3)中吸取水相體積為400yL。
[0024] 更進一步的，所述步驟c4)中離心條件為12000g4°C離心15分鐘。
[0025] 更進一步的，所述步驟c4)中石永紅移液器以及濾紙吸取管壁及官底殘余液體。
[0026] 更進一步的，所述步驟c8)中取2yL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，IyL進行濃度測 定。
[0027] 有益效果：本發(fā)明提供的一種稻飛虱翅中總RNA高效提取的方法，與傳統(tǒng)利用 Trizol提取RNA相比具有以下優(yōu)點：方法簡單方便，只需要在步驟中加入冷凍貯存及石英 砂助研磨，就能高效的提取出飛虱翅翼中總RNA，提取的翅中總RNA，不被外源或內(nèi)源RNA酶 降解到最低限度，能最大限度地保持被提取的總RNA的純度，以利于后續(xù)試驗的利用；獲得 的翅中總RNA純度高、完整度好，濃度滿足多種實驗需求，可用于反轉(zhuǎn)錄cDNA、PCR、qPCR等 下游操作等分子生物學的操作應用，實用價值顯著。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明實施例獲得的產(chǎn)物在瓊脂糖電泳后得到的條帶。
[0029] 圖2為本發(fā)明實施例獲得的產(chǎn)物通過逆轉(zhuǎn)錄及通過PCR擴增褐飛虱翅中wingless 基因的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明：
[0031] 1)試驗步驟：
[0032] 選取褐飛虱作為試驗對象。
[0033] a)實驗用具及耗材滅菌及RNA酶滅活處理：用0. 1 %DEPC水溶液浸泡實驗器材和 槍頭24h以上，部分耗材利用滅菌鍋高溫高壓濕熱滅菌處理，玻璃棒及石英砂等利用干燥 箱200°C干熱滅菌處理2h以上；工作臺面用RNA酶清除劑擦拭干凈；解剖針置于無水乙醇 中浸泡后用酒精燈進行灼燒滅活處理；
[0034] b)褐飛虱翅的分離：用吸管吸取一定數(shù)量的褐飛虱放入離心管中迅速置于液氮 罐中數(shù)十秒，使其迅速死亡，利用無RNA酶水漂洗兩次后用滅菌后的解剖針迅速解離出稻 飛虱翅部，避免殘留翅根部肌肉組織帶入，利用解剖針挑取翅翼裝入已加入300yLTrizol 試劑的離心管中，并放置在冰上，減少RNA分解，收集到長翅60頭以上，短翅120頭以上的 稻飛虱翅翼后，將離心管置于_40°C保存24h;
[0035] c)總RNA的提?。?br>[0036] cl)打開低溫高速離心機-4°C進行預冷處理，在室溫下超凈臺中解凍步驟b得到 的樣品，待樣品處于熔融狀態(tài)時利用高溫滅菌后的玻璃棒沿著管壁研磨翅翼，待研磨難以 進行時加入200目規(guī)格0.Olg石英砂助研磨，使翅脈中內(nèi)容物充分釋放，研磨完畢再加入 700yLTrizol試劑，混勻靜置2min;
[0037] c2)加入200yL氯仿，劇烈振蕩15s后室溫靜置5min;
[0038] c3)將上述混合物12000g4°C離心15min，上清液轉(zhuǎn)移新的離心管中，加入與上清 液等體積的異丙醇溶液，輕輕顛倒混勻后室溫下靜置IOmin;