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      一種重組慢病毒及其在制備治療可卡因成癮的藥物中的用圖_3

      文檔序號:9367736閱讀:來源:國知局
      劑盒,購自澳大利亞ProteinOne公司。
      [0172] (6)RIPA裂解液,購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。
      [0173] (7)BCA法蛋白濃度測定試劑盒,購自美國Pierce公司。
      [0174] (8) 5XSDS-PAGE電泳緩沖液,購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。
      [0175] (9)303^^^試劑(30%聚丙烯酰胺,1^8^^6,303,過硫酸銨,了£10,甘氨酸), 0. 22yM孔徑PVDF膜,購自美國Bio-Rad公司。
      [0176] (10)預(yù)染蛋白質(zhì)marker,購自美國ThermoScientfic(Fermentas)公司。
      [0177] (11)化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒,購自美國Pierce。
      [0178] (12)Kodak柯達(dá)膠片,購自美國柯達(dá)公司。
      [0179](13)抗體:兔抗小鼠HMGCS2單克隆抗體(ab137043),兔抗小鼠GCK多克隆抗 體(ab37796),購自Abcam公司;兔抗小鼠 0-actin抗體(4697),購自CellSignaling Technology公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(AS014),購自Abclonal公司。
      [0180] (14)沉默Hmgcs2慢病毒和對照慢病毒,由廣州賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建。
      [0181] (15)液氮,購自成都僑源氣體有限公司。
      [0182] (16)氮氣,購自成都僑源氣體有限公司。
      [0183] (17)色譜級甲醇,購自美國Fisherscientific公司。
      [0184] (18)色譜級氯仿,購自西班牙Scharlau公司。
      [0185] (19)気代重水,購自美國CIL(CambridgeIsotopeLaboratories)公司。
      [0186] (20)TSP,購自美國Sigma-Aldrich公司。
      [0187] (21)Trizol,購自美國Invitrogenlifetechnologies公司。
      [0188] (22)無水乙醇,購自上?;瘜W(xué)試劑有限公司。
      [0189] (23)無DNA酶/RNA酶去離子水,購自北京天根生化科技有限公司。
      [0190] (24)GoldView染料,購自上海賽百勝基因技術(shù)有限公司。
      [0191] (25)瓊脂糖,購自美國Amerosco公司。
      [0192] (26)PrimeScriptRTreagentkit(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒),購自美國Bio-Rad公司。
      [0193] (27)SYBRGreenSupermixkit,購自美國Bio-Rad公司。
      [0194] (28)乙酰輔酶A檢測試劑盒,購自美國Sigma-Aldrich公司。
      [0195](29)ATP檢測試劑盒、NAD+/NADH檢測試劑盒和檸檬酸合酶活性檢測試劑盒,購自 美國Abcam公司。
      [0196]
      [0197] (30)其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。
      [0198] 2. 1. 2主要試劑的配制
      [0199] (I)SDS-PAGE電泳緩沖液:向 15.IgTris_base、94g甘氨酸和 5gSDS,中加入 800mL雙蒸水,攪拌溶解后定容至lOOOmL,室溫保存。
      [0200] (2)轉(zhuǎn)膜緩沖液:向2. 9g甘氨酸、5. 8g Tris-base和0?37gSDS中加入600mL雙 蒸水,攪拌溶解后定容至800mL,最后加入200mL甲醇,室溫保存。
      [0201] (3) 10XTBS緩沖液:向 60. 5gTris-base,87. 5gNaCl中加入 800mL雙蒸水,攪拌 溶解后滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為7. 4,最后定容至lOOOmL,室溫保存。
      [0202] (4)TBST緩沖液:用10XTBS緩沖液配制1000 mLIXTBS緩沖液,然后加入ImL Tween20充分混勻,室溫保存。
      [0203] (5)封閉緩沖液:向5g脫脂奶粉中加入IOOmLTBST緩沖液,攪拌溶解立即使用或 4°C保存(現(xiàn)用現(xiàn)配)。
      [0204] (6)抗體緩沖液:向5g牛血清白蛋白加入到IOOmLTBST緩沖液,攪拌溶解立即使 用或4°C保存(現(xiàn)用現(xiàn)配)。
      [0205] 2.L3實驗器械
      [0206] (1)腦立體定位儀,套管,平口微量進(jìn)樣器(lyL,5iiL),購自深圳瑞沃德公司。
      [0207] (2)超聲破碎儀,購自寧波新芝科器研究所。
      [0208] (3)X-射線膠片自動洗片機(jī):購自德國Protec GmbH公司。
      [0209](4)制冰機(jī),購自美國Scotsman公司。
      [0210] (5)高速低溫離心機(jī),購自德國Eppendorff公司。
      [0211] (6)蛋白質(zhì)電泳槽及電泳電源,購自美國Bio-Rad公司。
      [0212] (7)凝膠成像儀,購自美國Bio-Rad公司。
      [0213] (8)小鼠位置偏好箱,購自淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司。
      [0214](9)小鼠自發(fā)活動箱,購自淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司。
      [0215] (10)酶標(biāo)儀,購自美國Thermo scientific公司。
      [0216] (11)多標(biāo)記檢測儀,購自美國PerkinElmer公司。
      [0217] (1)稱量紙,購自成都溶海科技有限公司。
      [0218] (2)藥匙,購自成都寶信生物工程有限公司。
      [0219](3)抗凝管,購自江蘇康健醫(yī)療用品有限公司。
      [0220] (4)I. 5mL離心管,購自美國Axygen公司。
      [0221] (5) 15mL和50mL離心管,購自美國Corning公司。
      [0222] (6)吸頭(lmL,200yL,10yL),購自美國Axygen公司。
      [0223] (7) 5mm核磁管,購自美國Sigma-Aldrich公司。
      [0224] (8) 5L液氮罐,購自成都金鳳液氮容器有限公司。
      [0225] (9)解剖器械,購自成都溶海科技有限公司。
      [0226] (10)電子分析天平,購自德國Sartorius公司。
      [0227] (11)移液器,購自德國Eppendorff公司。
      [0228](12)冰箱(4°C,_20°C),購自日本Sanyo公司。
      [0229] (13)超低溫冰箱(_80°C),購自日本Sanyo公司。
      [0230] (14)純水儀,購自德國Merckmillipore公司。
      [0231] (15)離心機(jī),購自美國Thermoscientific公司。
      [0232] (16)制冰機(jī),購自美國Scotsman公司。
      [0233] (17)氮吹儀,購自成都云鴻科技發(fā)展有限公司。
      [0234] (18)生物安全柜,購自江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司。
      [0235] (19)超聲破碎儀,購自寧波新芝科器研究所。
      [0236] (20)高速低溫離心機(jī),購自德國Eppendorff公司。
      [0237] (21)核酸電泳裝置,購自美國Bio-Rad公司。
      [0238] (22)PCR擴(kuò)增儀,購自美國MultigeneGradient公司。
      [0239] (23)Real-TimePCR儀,購自美國Bio-Rad公司。
      [0240] (24)全自動血液生化分析儀,購自瑞士Roche公司。
      [0241] (25)脫色搖床,購自成都建欣實驗儀器有限公司。
      [0242] (26)渦旋震蕩器,購自德國IKA公司。
      [0243] (27)恒溫孵育箱,購自廣州德祥科技有限公司。
      [0244] 2. 2實驗動物
      [0245] 雄性SPF級健康性成熟(10-12周)C57BL/6J小鼠,購自北京維通利華實驗動物技 術(shù)有限公司,體重20-22g,未交配過。飼養(yǎng)條件:國家成都新藥安全性評價中心SPF級動物 房,溫度20-25°C,相對濕度55-65%,整個實驗過程中,動物自由攝食和飲水。飼養(yǎng)環(huán)境符 合國標(biāo)GB14925-2001,實驗動物許可證:SCXK(川)2003-01。
      [0246] 2. 3腦立體定位手術(shù)
      [0247] 腦立體定位-埋管手術(shù):將小鼠用戊巴比妥鈉(50mg/kg,i.p.)麻醉后固定頭部, 并暴露顱骨。按照伏隔核腦區(qū)坐標(biāo)[32] (AP+1. 6 ;ML±I. 0;DV- 4. 5)向雙側(cè)伏隔核腦區(qū)植入 套管,并用牙科水泥固定。牙科水泥干后縫合傷口,擰緊套管帽。將動物置于電熱毯上恢復(fù) 7天,并每天給予青霉素肌注抗感染。
      [0248] 腦立體定位-慢病毒注射手術(shù):將小鼠用戊巴比妥鈉(50mg/kg,i.p.)麻醉后固定 頭部,并暴露顱骨。按照伏隔核腦區(qū)坐標(biāo)(AP+1.6 ;ML±1.0 ;DV-4. 5),將預(yù)先裝載了病毒 (0. 25yL/側(cè))的微量注射針植入雙側(cè)伏隔核腦區(qū)后,以0.IyL/min的速度將病毒注射到 伏隔核腦區(qū)。注射完畢后,留針5min再退針。縫合傷口,將動物置于電熱毯上恢復(fù)7天。
      [0249]腦立體定位-慢病毒注射手術(shù):將小鼠用戊巴比妥鈉(50mg/kg,i.p.)麻醉后固定 頭部,并暴露顱骨。按照伏隔核腦區(qū)坐標(biāo)(AP+1.6 ;ML±1.0 ;DV-4. 5),將預(yù)先裝載了病毒 (0. 25yL/側(cè))的微量注射針植入雙側(cè)伏隔核腦區(qū)后,以0.IyL/min的速度將病毒注射到 伏隔核腦區(qū)。注射完畢后,留針5min再退針。縫合傷口,將動物置于電熱毯上恢復(fù)7天。
      [0250] 2. 4腦內(nèi)使用試劑配制及給藥方式
      [0251]Hymeglusin:白色粉末,不溶于水,溶于DMS0,溶解度是lmg/mL。溶劑對照的配制: 用生理鹽水按相應(yīng)比例稀釋DMSO。由于還未有研究者將Hymeglusin應(yīng)用于動物試驗,給藥 劑量為Iyg/mL,于可卡因給藥前30分鐘,以0.IyL/min向腦內(nèi)注射Hymglusin或溶劑對 照,給藥體積為IyL/側(cè)。
      [0252] 2. 5 構(gòu)建shRNA-HMGCS2 慢病毒()
      [0253] 按照實施例1的方法構(gòu)建shRNA_HMGCS2慢病毒。2. 6可卡因條件性位置偏好模型 的建立
      [0254] 動物實驗中所有操作均符合AAALAC要求,小鼠條件性位置偏好(CPP)模型建立方 法如下,小鼠位置偏好箱如圖1所示:
      [0255] 開始試驗前3-5天,每天由同一操作人員對小鼠進(jìn)行撫摸,讓動物對操作人員有 一定的適應(yīng)。
      [0256] 將小鼠放入CPP箱體內(nèi),將CPP箱體隔板通道口打開,讓動物在箱體內(nèi)自由穿 梭,適應(yīng)性訓(xùn)練三天,第四天測定動物在黑箱和白箱停留的時間及穿梭次數(shù)作為初始測試 (Pretest)的數(shù)據(jù)。每次適應(yīng)訓(xùn)練和測試時間均為15分鐘。初始測試時,當(dāng)動物在一側(cè)(黑 白兩側(cè))停留的時間差(Pretestscore)超過200s或穿梭次數(shù)低于20次時,應(yīng)當(dāng)剔除。
      [0257] 將動物停留時間較長的一側(cè)作為自然偏好箱,然后進(jìn)行腹腔注射給藥,給藥劑量 如下(表1)。
      [0258] 連續(xù)給藥6天。鹽酸可卡因組給予生理鹽水時放入自然偏好箱;給予鹽酸可卡因 時,放入非自然偏好箱,每次訓(xùn)練15分鐘。對照組每次給予生理鹽水并放入對應(yīng)箱體內(nèi)(圖 2)〇
      [0259] 第11天將CPP箱體隔板通道口打開,讓動物自由穿梭,并測定動物在黑箱和白箱 停留的時間及穿梭次數(shù)。本次測試時,將動物在初始偏好箱中停留的時間與初始非偏好箱 中停留的時間差記錄為Prest score。測試結(jié)束30分鐘內(nèi)解剖動物。
      [0260] 動物的CPP評分即為Test score與Pretest score的差值。
      [0261] 表1可卡因給藥途徑、給藥劑量、給藥體積匯總表
      [0262]
      [0263] 2. 7小鼠行為敏化模型
      [0264] 動
      當(dāng)前第3頁1 2 3 4 
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