制備克隆小型動(dòng)物胚胎的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及制備克隆小型動(dòng)物胚胎 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 體細(xì)胞核移植又稱克隆，是動(dòng)物細(xì)胞工程中最常用的技術(shù)手段。通過電擊法或直 接顯微注射法將具有較高分化程度的體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至卵母細(xì)胞中，再經(jīng)過化學(xué)激活，使其重 新編程發(fā)育成胚胎，將其移植入代孕母體內(nèi)，出生完整個(gè)體。1996年通過傳統(tǒng)克隆技術(shù)，在 顯微操作儀器輔助下，首次獲得的體細(xì)胞克隆綿羊。2001年，科學(xué)家GavorVajta首次提出 了手工克隆技術(shù)，該技術(shù)在體視顯微鏡下，手持特制刀片將無透明帶卵母細(xì)胞的核切除，從 而達(dá)到去核目的。手工克隆與傳統(tǒng)克隆相比，無需使用顯微操作儀，及尖端的技術(shù)人員。但 這些技術(shù)方法主要適用于大動(dòng)物。
[0003] 因而，現(xiàn)階段適于小型動(dòng)物的手工克隆技術(shù)的研究具有重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的 一個(gè)目的在于提出一種適于小型動(dòng)物，并能夠有效保證囊胚形成率的手工克隆技術(shù)。
[0005] 因而，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備克隆小型動(dòng)物胚胎的方法。 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟：提供離體的供體核細(xì)胞；提供離體的卵母細(xì) 胞；于含有透明帶消化劑的卵母細(xì)胞去核液中，將所述卵母細(xì)胞進(jìn)行去核處理，以便獲得去 核卵母細(xì)胞；將所述去核卵母細(xì)胞與所述供體核細(xì)胞融合，以便獲得重構(gòu)胚；將所述重構(gòu) 胚進(jìn)行體外激活，以便獲得激活的重構(gòu)胚；以及將所述激活的重構(gòu)胚進(jìn)行培養(yǎng)，以便獲得所 述克隆小型動(dòng)物胚胎。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的方法，能夠在透明帶為半消化狀 態(tài)，即在消化透明帶的同時(shí)，適時(shí)快速進(jìn)行切割去核，從而操作人員可以精確的把握去核時(shí) 間，成功實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞去核，并保證囊胚形成率，高效制備克隆小型動(dòng)物胚胎。此外，根據(jù)本 發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的方法成本低、操作簡(jiǎn)單，易于推廣。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明制備克隆小型動(dòng)物胚胎的方法還可以進(jìn)一步具有下 列附加技術(shù)特征：
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述透明帶消化劑為選自鏈蛋白酶和細(xì)胞松弛素B的至少 一種。由此，能夠有效消化透明帶，便于精準(zhǔn)的把握去核時(shí)間，易于去核操作。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述卵母細(xì)胞去核液中包含：5-15i!g/mL鏈蛋白酶；和/或 1-5yg/mL細(xì)胞松弛素B。由此，透明帶半消化效果較好，易于去核操作。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述卵母細(xì)胞去核液中包含：IOyg/mL鏈蛋白酶；和/或 2. 5yg/mL細(xì)胞松弛素B。由此，透明帶半消化效果好，易于去核操作。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述卵母細(xì)胞去核液中進(jìn)一步包含：5-15體積％的TCM199 培養(yǎng)基；〇? 1-0. 3mg/mL碳酸氫鈉；0? 1-0. 3mg/mL丙酮酸鈉；3-4mg/mL赫佩斯鈉鹽；2-3mg/ mL赫佩斯酸；0. 1-0. 3mg/mL谷氨酰胺；以及15-25體積％的牛血清。由此，能夠有效提高卵 母細(xì)胞去核后的成活率。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述卵母細(xì)胞去核液中包含：1〇體積％的TCM199培養(yǎng)基； 0? 17mg/mL碳酸氫鈉；0? 20mg/mL丙酮酸鈉；3. 60mg/mL赫佩斯鈉鹽；2. 63mg/mL赫佩斯酸； 0. 20mg/mL谷氨酰胺；以及20體積％的牛血清。由此，去核過程中，卵母細(xì)胞損傷小，能夠 有效提高卵母細(xì)胞去核后的成活率。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)所述卵母細(xì)胞的透明帶半消化時(shí)，根據(jù)極體定位的方法， 將所述卵母細(xì)胞的第一極體連同部分卵母細(xì)胞質(zhì)切除，以便實(shí)現(xiàn)所述去核處理。由此，能夠 適時(shí)快速進(jìn)行切割去核，操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞損傷小，去核成功率高。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將所述去核卵母細(xì)胞與所述供體核細(xì)胞融合，包括：將所 述去核卵母細(xì)胞均分為兩組；將其中一組去核卵母細(xì)胞與所述供體核細(xì)胞進(jìn)行第一融合， 以便形成去核卵母細(xì)胞-體細(xì)胞復(fù)合體；以及將另一組去核卵母細(xì)胞與所述去核卵母細(xì) 胞-體細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行第二融合，以便形成三體結(jié)構(gòu)的去核卵母細(xì)胞-體細(xì)胞-去核卵母 細(xì)胞，所述三體結(jié)構(gòu)的去核卵母細(xì)胞-體細(xì)胞-去核卵母細(xì)胞即為所述重構(gòu)胚。由此，融合 效果好，重構(gòu)胚的成活率高，進(jìn)而能夠有效提高囊胚形成率。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用細(xì)胞融合儀，于融合操作液中進(jìn)行所述第一融合和 所述第二融合，其中，所述融合操作液包含：54. 65mg/mL甘露醇；lmg/mL聚乙烯醇；以及 0. 145mg/mL硫酸鎂，所述細(xì)胞融合儀的參數(shù)設(shè)置為DC80V、40iis、AC9V。由此，能夠促進(jìn)細(xì) 胞融合，并進(jìn)一步提高囊胚形成率。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將所述重構(gòu)胚置于化學(xué)激活操作液中，于37°C、5%的二氧 化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-8小時(shí)，優(yōu)選6小時(shí)，以便實(shí)現(xiàn)所述體外激活，其中，所述化學(xué)激活操作 液包含：4. 789mg/mL氯化鈉；0. 36mg/mL氯化鉀；0. 159mg/mL磷酸鉀；0. 291mg/mL七水硫酸 鎂；2.lmg/mL碳酸氫鈉；lmg/mL葡萄糖；0? 029mg/mL丙酮酸鈉；0? 146mg/mL谷氨酰胺；0? 37 體積％的乳酸鈉（60%糖楽）；0. 038mg/mL乙二胺四乙酸；0.lmg/mL聚乙烯醇；5mg/mL牛血 清白蛋白；5yg/mL細(xì)胞松弛素B;以及2. 666mg/mL六水氯化鍶。由此，能夠有效激活重構(gòu) 胚，進(jìn)而促進(jìn)囊胚形成，提高囊胚形成率。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將所述激活的重構(gòu)胚置于胚胎培養(yǎng)液中，于37°C、5%的二 氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)100-120小時(shí)優(yōu)選108小時(shí)，以便獲得所述克隆小鼠胚胎，其中，所述 胚胎培養(yǎng)液包含：4. 789mg/mL氯化鈉；0. 36mg/mL氯化鉀；0. 159mg/mL磷酸鉀；0. 291mg/mL 七水硫酸鎂；2.lmg/mL碳酸氫鈉；lmg/mL葡萄糖；0. 029mg/mL丙酮酸鈉；0. 251mg/mL二水 氯化I丐；〇? 146mg/mL谷氨酰胺；0? 37體積％的乳酸鈉；0? 038mg/mL乙二胺四乙酸；0?Img/ mL聚乙烯醇；以及5mg/mL牛血清白蛋白。由此，能夠有效促進(jìn)激活后的重構(gòu)胚發(fā)育形成囊 胚，提高囊胚形成率。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述小型動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為鼠科、兔科、貓科、或犬科 的至少一種，更優(yōu)選為小鼠。
【附圖說明】
[0018]圖1是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，切割未消化透明帶細(xì)胞，去核刀未觸碰到卵母細(xì) 胞胞質(zhì)中細(xì)胞核的部分的顯微鏡示意圖；
[0019] 圖2是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，切割未消化透明帶細(xì)胞，去核刀暴力擠壓下，透明 帶中卵母細(xì)胞胞質(zhì)渙散，卵母細(xì)胞死亡的顯微鏡示意圖；
[0020] 圖3是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的去核操作盤示意圖；
[0021] 圖4是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的融合操作盤示意圖；
[0022] 圖5是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的培養(yǎng)盤TK意圖；
[0023] 圖6是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，小鼠第二次減數(shù)分裂中期卵母細(xì)胞的顯微圖片；
[0024] 圖7是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，CF-C細(xì)胞系小鼠供體核細(xì)胞，在200倍倒置相差 顯微鏡條件下的顯微圖片；
[0025] 圖8是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，半消化透明帶條件下，去核刀切割含有細(xì)胞核部 分的卵母細(xì)胞胞質(zhì)的顯微圖片；
[0026] 圖9是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，小鼠手工克隆重構(gòu)胚培養(yǎng)108小時(shí)后形成的囊胚， 在20倍體視顯微鏡條件下的顯微圖片；以及
[0027] 圖10是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，小鼠手工克隆重構(gòu)胚培養(yǎng)108小時(shí)后形成的囊 胚，在56倍體視顯微鏡條件下的顯微圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本 發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0029] 在本發(fā)明的描述中，術(shù)語"第一"、"第二"僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗 示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有"第一"、"第二"的特 征可以明示或者隱含地包括至少一個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，"多個(gè)"的含義是至少兩 個(gè)，例如兩個(gè)，三個(gè)等，除非另有明確具體的限定。
[0030] 需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0031] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與豬牛羊等大動(dòng)物相比，小型動(dòng)物的卵子體積小，胞質(zhì)也較為脆弱， 在按照現(xiàn)有技術(shù)去除卵母細(xì)胞核的操作過程中，去核刀如果直接擠壓未經(jīng)過預(yù)處理的透明 帶，會(huì)出現(xiàn)以下兩種情況：情況一：卵母細(xì)胞翻滾，去核刀未觸碰到卵母細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)胞核 的部分（如圖1所示）；情況二：去核刀暴力擠壓，導(dǎo)致透明帶中卵母細(xì)胞胞質(zhì)渙散，卵母細(xì) 胞死亡（