一種黃藍(lán)狀菌生產(chǎn)(r)-苯基茚醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到黃藍(lán)狀菌細(xì)胞生物催化制備手性醫(yī)藥 中間體（R)-3-苯基-茚醇的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性（R)-3_苯基-茚醇是合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥品和其他特殊材料的 重要中間體。生物催化不對稱反應(yīng)具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，作為綠色高 效制備手性化合物的優(yōu)先途徑，被越來越多地應(yīng)用于生產(chǎn)一些高附加值的手性化合物。生 物催化制備手性（R)-3-苯基-茚醇具有很好的應(yīng)用前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、選擇性強(qiáng)、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點(diǎn)，是可持續(xù) 發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物 催化最具吸引力的應(yīng)用領(lǐng)域。在作為生物催化劑的六大類酶中，水解酶能夠催化動(dòng)力學(xué)拆 分外消旋體得到手性產(chǎn)品，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來，氧化還原 酶在工業(yè)上的應(yīng)用得到了迅速增長。目前，采用水解酶動(dòng)力學(xué)拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業(yè)制備光學(xué)活性手性化合物的比例為4:2:1。
[0004] 生物還原法相對于動(dòng)力學(xué)拆分法而言，最大的優(yōu)勢在于理論收率可達(dá)100%，原子 經(jīng)濟(jì)性好。然而生物還原反應(yīng)需要輔酶或輔因子的參與，一定程度上限制了其應(yīng)用。由于 輔酶依賴性的緣故，生物還原反應(yīng)中多釆用整細(xì)胞作為催化劑，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)輔酶循環(huán)再生的 同時(shí)免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (R) _3_苯基-諱醇是合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥品的重要手性砌塊，?，F(xiàn)有 的方法普遍存在轉(zhuǎn)化率低、反應(yīng)時(shí)間長、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴(yán)重缺陷，難于進(jìn)行 工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將采用生物細(xì)胞催化制備（R)-3-苯基-茚醇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明采用黃藍(lán)狀菌細(xì)胞催化制備（R)-3-苯基-茚醇，反應(yīng)式如下：
3-苯基茚酮（1)經(jīng)黃藍(lán)狀菌催化反應(yīng)，得到產(chǎn)物（R)-3-苯基-茚醇（2)。有多種微 生物可以催化此反應(yīng)，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)篩選，最終確定采用黃藍(lán)狀菌作為催化劑，因?yàn)槠浯呋?反應(yīng)的效果最好，反應(yīng)收率、對映體過量率（ee%)均很高。
[0007] 許多黃藍(lán)狀菌都可以進(jìn)行生物催化此反應(yīng)，然而，其效果不同，相差很大，經(jīng)實(shí)驗(yàn)， 本發(fā)明選用黃藍(lán)狀菌菌株為ATCC18325，其催化反應(yīng)效果最佳。
[0008] 由于絕大多數(shù)氧化還原酶是輔酶NAD(P)H依賴型，而細(xì)胞本身所含有的輔酶量 可能較少，因此，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)時(shí)，為促進(jìn)輔酶再生，提高反應(yīng)效率，在反應(yīng)體系中 還添加輔助底物構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系。常用的輔助底物種類較多，不同細(xì)胞所需的輔助底物不同， 效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)才能確定最佳 的輔助底物。本發(fā)明經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)確定的輔助底物為：木糖40-45g/L、蔗糖25-28g/L、麥芽 糖22-24g/L、異丙醇5-6%V/V(體積濃度）。
[0009] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養(yǎng)介質(zhì)： 1、種子培養(yǎng)基成份為：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀I. 8-2. 3g/L;配制 固體培養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉。
[0011] 2、培養(yǎng)液成份：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，黃豆粉3-4g/L，酵母浸 膏 8-10g/L，葡萄糖 18-22g/L，麥芽浸膏 20-25g，硫酸銨 0.5-0. 7g/L，硫酸鎂 0.3-0. 4g/ L，磷酸二氧鉀1.8-2. 3g/L，碳酸鈣0.7g/L，硫酸亞鐵0.18g/L，硫酸錳0.025g/L;pH 5. 3〇
[0012] 2、固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0013] 黃藍(lán)狀菌細(xì)胞制備。黃藍(lán)狀菌經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā)酵罐加入 培養(yǎng)液，121°c高壓滅菌30分鐘，冷卻至26-27°C，將黃藍(lán)狀菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種 比例為9-10%，通氣比為0.9-1￥八￥分鐘），26-27°(：培養(yǎng)41-45小時(shí)，用過濾式離心機(jī)離心 得到濕黃藍(lán)狀菌細(xì)胞，用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0014] 生物催化轉(zhuǎn)化。底部通氣攪拌反應(yīng)罐中加入磷酸鹽緩沖液，pH為5. 8,加入底物 3-苯基茚酮，使底物濃度為80-90g/L。其他成份：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為19-20g/ L，蔗糖酯 17-18g/L，木糖 40-45g/L、蔗糖 25-28g/L、麥芽糖 22-24g/L、異丙醇 5-6%V/V(體 積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至23-24°C時(shí)，加入濕黃藍(lán)狀菌細(xì)胞使其濃度為 80-83g/L，通氣比為0. 12-0. 13VAV分鐘)，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為76-79小時(shí)；反 應(yīng)結(jié)束后，濾出細(xì)胞，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物（R)-3-苯基-茚醇 ，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率98-99 %，產(chǎn)品收率96-97 %，對映體過量率98. 5-99 %。
[0015] 本發(fā)明所開展工作包括菌株選擇、催化反應(yīng)條件優(yōu)化(反應(yīng)溫度、通氣量、pH)、反 應(yīng)介質(zhì)選擇和濃度優(yōu)化，包括底物濃度、輔助底物組合、表面活性劑種類及濃度等。
[0016] 實(shí)施例1 種子培養(yǎng)基成份為：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡 萄糖20g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀I. 8-2. 3g/L;配制固體 培養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉。
[0017] 培養(yǎng)液成份為：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，黃豆粉3-4g/L，酵母浸 膏8-10g/L，葡萄糖18-22g/L，麥芽浸膏20-25g，硫酸銨0.5-0. 7g/L，硫酸鎂0.3-0. 4g/ L，磷酸二氧鉀1.8-2. 3g/L，碳酸鈣0.7g/L，硫酸亞鐵0.18g/L，硫酸錳0.025g/L;pH5. 3〇
[0018] 濕黃藍(lán)狀菌細(xì)胞制備過程如下：黃藍(lán)狀菌ATCC18325經(jīng)斜面、搖瓶培養(yǎng)，得到種 子液。IL發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至26-27°C， 將黃藍(lán)狀菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為接種比例為9-10%，通氣比為0. 9-1V/ (V分 鐘)，26-27°C培養(yǎng)41-45小時(shí)，用過濾式離心機(jī)離心得到濕黃藍(lán)狀菌細(xì)胞，用作生物催化反 應(yīng)催化劑。
[0019] 生物催化轉(zhuǎn)化：0. 5L底部通氣攪拌反應(yīng)器中加入磷酸鹽緩沖液，pH為5. 8,加入 底物3-苯基茚酮，使其濃度為80g/L，玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為20g/L，蔗糖酯17g/ L，木糖40g/L、蔗糖28g/L、麥芽糖22g/L、異丙醇6%V/V(體積濃度），121°C高壓滅菌30分 鐘；冷卻至23°C時(shí)，加入濕黃藍(lán)狀菌細(xì)胞使其濃度為80g/L，通氣比為0. 12V/ (V分鐘)，進(jìn) 行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為79小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，濾出細(xì)胞，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，蒸 出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物（R)-3-苯基-茚醇，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率99%，產(chǎn)品收率97%，對映體過量 率 98. 5%。
[0020] 實(shí)施例2 種子培養(yǎng)基成份為：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡 萄糖20g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀I. 8-2. 3g/L;配制固體 培養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉。
[0021] 培養(yǎng)液成份為：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35