一種產(chǎn)二甲基二硫醚(dmds)的惡臭馬賽菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001 ] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能產(chǎn)二甲基二硫醚（Dimethyl disulfide，DMDS)的細(xì)菌新物種一惡臭馬賽菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 土壤熏蒸劑能夠有效防治土傳病害，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的被廣泛應(yīng)用。其中，溴甲烷在 過去的幾十年是最常用的熏蒸劑，但由于其破壞大氣臭氧層，嚴(yán)重危害到地球環(huán)境和人類 健康，在《蒙特利爾議定書》中被列為限控物質(zhì)，2015年以后將在世界范圍內(nèi)被禁止使用。 二甲基二硫醚（DMDS)對害蟲具有觸殺和胃毒作用，對作物具有一定滲透性，但無內(nèi)吸傳導(dǎo) 作用，殺蟲廣譜，作用迅速，是聯(lián)合國溴甲烷技術(shù)選擇委員會提出的一種新型的土壤熏蒸劑 替代品。研究表明二甲基二硫醚（DMDS)具有殺滅土壤線蟲、土壤病原真菌、雜草及地下害 蟲的效果，對土壤中的線蟲及有害真菌均具有較強(qiáng)的防治效果，作為新型的土壤熏蒸劑得 到了廣泛的認(rèn)可。目前，關(guān)于產(chǎn)二甲基二硫醚的微生物及其在土壤病蟲害防治應(yīng)用中的研 究尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種能夠產(chǎn)二甲基二硫醚（DMDS)的微生物新物種一 惡臭馬賽菌（Massiliaputida)6NM_7。該菌株于2015年7月14日保藏于中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中 國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo: 11070。
[0004] 本發(fā)明的惡臭馬賽菌（Massiliaputida)6NM_7能產(chǎn)生二甲基二硫醚，而二甲基二 硫醚是一種極為重要的防治土傳病害的新型土壤熏蒸劑的主要成分。
[0005] 因此，本發(fā)明的第二個目的是提供惡臭馬賽菌（Massiliaputida)6NM_7在制備二 甲基二硫醚中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第三個目的是提供惡臭馬賽菌（Massiliaputida)6NM-7在制備土壤熏 蒸劑中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的惡臭馬賽菌（Massiliaputida)6NM_7,其是一種微生物新種，能產(chǎn)二甲 基二硫醚（DMDS)，在防治土傳病害和研發(fā)新型土壤熏蒸劑上具有重要的應(yīng)用價值。
[0008] 本發(fā)明的惡臭馬賽菌（Massiliaputida) 6NM-7已于2015年7月14日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo: 11070。
【附圖說明】：
[0009] 圖1為本發(fā)明的惡臭馬賽菌6NM-7的透射電子顯微鏡照片；
[0010]圖2為本發(fā)明的惡臭馬賽菌6NM-7基于其16SrRNA基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育 樹；
[0011] 圖3為本發(fā)明的惡臭馬賽菌6NM-7產(chǎn)二甲基二硫醚（DMDS)的GC-MS分析，圖3A 為惡臭氣體的GC分析，圖3B為4. 6min的組份經(jīng)過質(zhì)譜分析為二甲基二硫醚（DMDS)。
【具體實(shí)施方式】：
[0012] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0013] 實(shí)施例1:
[0014] 一、惡臭馬賽菌6NM-7的分離。
[0015] 本發(fā)明的惡臭馬賽菌6NM-7是從江西大余縣鎢礦區(qū)采集的礦砂樣品中分離培養(yǎng) 得到的。具體分離方法為：取l〇g礦砂樣品于裝有90mL無菌水的三角瓶中，180rpm搖床振 蕩過夜，取上清液lmL按10倍梯度逐級稀釋，分別將0.lmL不同梯度的稀釋液涂布于R2A 培養(yǎng)基上。30°C倒置培養(yǎng)7天。挑取不同形態(tài)的菌落過程中獲得菌株6NM-7(惡臭馬賽菌 (Massiliaputida)6NM_7)。
[0016] 所述的R2A培養(yǎng)基配方為：酵母提取物0. 5g,蛋白胨0. 5g,酸水解干酪素0. 5g,葡 萄糖 〇? 5g，可溶性淀粉 0? 5g，K2HP040 . 3g，MgS04 ? 7H20 0? 05g，丙酮酸鈉 0? 3g，瓊脂粉 20g， 雙蒸水1000mL，pH7. 0~7. 4。將上述組份混合均勻后，滅菌備用。
[0017] 二、惡臭馬賽菌6NM-7的鑒定
[0018] 1.表型特征：將菌株6NM-7采用三區(qū)劃線接種于R2A培養(yǎng)基上，置于30°C培養(yǎng)箱 培養(yǎng)3天，取出觀察菌落特征。細(xì)胞形態(tài)觀察（圖1)、革蘭氏染色、淀粉水解、運(yùn)動性實(shí)驗(yàn)、 接觸酶等測定參見《常見細(xì)菌鑒定手冊》。氧化酶、0 _半乳糖苷酶、尿酶、精氨酸雙水解酶、 葡萄糖發(fā)酵、吲哚、硝酸鹽還原、水解七葉靈和明膠等采用API20NE試劑條。惡臭馬賽菌 6NM-7對不同碳氮源的利用情況則分別采用了API20NE和BiologGNIII，操作按照說明書 進(jìn)行。
[0019] 形態(tài)特征：菌株6NM-7在R2A平板上30°C培養(yǎng)72h后菌落呈灰白色，圓形，邊緣規(guī) 則，表面粗糙，不透明（圖1)，菌落散發(fā)出強(qiáng)烈的農(nóng)藥氣味。細(xì)胞呈桿狀，單端有鞭毛，運(yùn)動， 無芽孢，好氧生長。
[0020] 生理生化特征：菌株6NM-7為革蘭氏染色為陰性，氧化酶、0 -半乳糖苷酶、尿酶、 精氨酸雙水解酶、葡萄糖發(fā)酵、吲哚、硝酸鹽還原、水解七葉靈均為陰性，接觸酶、淀粉水解 和明膠水解均為陽性，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、N-乙酰-葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄 糖酸鹽、海藻糖、蔗糖和D-半乳糖，但不能利用已二酸、蘋果酸、苯乙酸、檸檬酸、癸酸、甘露 醇、乳糖、0 _甲酰-D-葡糖苷、D-水楊苷、3-甲酰葡萄糖、D-巖藻糖和肌苷。
[0021] 將本發(fā)明的菌株6NM-7與其同源性最高的馬賽菌屬已發(fā)表模式菌株進(jìn)行了生理 生化特征的比較，結(jié)果如表1所示。
[0022] 表1菌株6NM-7與同源性最高的模式菌株微生物學(xué)特性比較
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[0025]注 1 :" 1 " 表不Massiliaputida6NM-7 ;"2" 表不M.norwichensisLMG281641; "3" 表示M.kyonggiensisKACC17471T;"4" 表示M.niastensisKACC12599T;"5" 表 示M.tieshanensisKACC14940T;"6" 表示M.haematophilaCCUG38318T;"7" 表示 M.namucuoensisCGMCC1.11014T;"8" 表示M.aerilataKACC12505 T.
[0026] 注2 :" + "表示陽性；表示陰性；"w"表示弱陽性；"ND"表示未測定。
[0027] 2.遺傳發(fā)育分析：采用細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行菌株6NM-7的16SrRNA基 因的PCR擴(kuò)增，將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)過切膠回收后克隆測序，獲得其序列信息（其核苷酸序 列如SEQIDNO. 1所示），將序列信息與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，得到與其相似度最高 的已發(fā)表模式種信息。采用生物學(xué)軟件MEGA5構(gòu)建菌株6NM-7的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所 不。
[0028] 16SrRNA基因擴(kuò)增和序列比對發(fā)現(xiàn)與Massiliaputida6NM-7(菌株6NM-7)最大 相似度模式菌株為MassilianorwichensisLMG28164T(98.7%)，Massiliakyonggiensis KACC17471T(98. 4 %),MassilianiastensisKACC12599T(97.8 %),Massilia tieshanensisKACC14940T(97. 3 %),MassiliahaematophilaCCUG 38318T(97.2 %)，MassilianamucuonensisCGMCC1.11014T(97.1 % )和Massilia aerilataKACC12505T(97.1%)。遺傳發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)該菌株屬于馬賽菌屬（Massilia)， 在進(jìn)化樹上與除MassiliahaematophilaCCUG383187和Massiliatieshanensis KACC149401的其他最大相似度模式菌株聚成一簇。DNA-DNA雜交結(jié)果顯示Massilia putida6NM-7 與MassilianorwichensisLMG28164T,Massi1iakyonggiensis KACC17471T,MassilianiastensisKACC125991,MassiliatieshanensisKACC 14940t,MassiliahaematophilaCCUG38318'MassilianamucuonensisCGMCC1. 110141 和MassiliaaerilataKACC125051雜交率分別為：59.7±4.8 %、48.1±3.0 %、 42. 3±2. 0%、19. 8±3. 7 %、45. 0±1. 2 %、20. 3±1. 8 % 和 24. 3±1. 2 %，DNA-DNA雜交結(jié) 果均小于70%，即小于國際公認(rèn)的新種臨界值（Wayneetal.，1987)，這表明Massilia putida6NM-7(菌株6NM-7)可能為馬賽菌屬的一個新物種。
[0029] 3.化學(xué)分類特征：DNA的G+C含量測定方法Mesbahetal. (1989)。DNA-DNA雜交 采用Lambda35紫外可見分光光度計(jì)測定，方法參照DeLeyetal. (1970)。脂肪酸提取和 測定采用MIDI公司的標(biāo)準(zhǔn)方法（Sasser, 1990)。
[0030] 將本發(fā)明的Massiliaputida6NM-7與其同源性最高的馬賽菌屬已發(fā)表模式種進(jìn) 行了脂肪酸組成成分的比較，結(jié)果如表2所示。
[0031] 表2Massiliaputida6NM-7與同源性最高的模式菌株脂肪酸組成比較（％ )
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[0033]

[0034]注 1 :" 1 " 表不Massiliaputida6NM-7 ;"2" 表不M.norwichensisLMG281641; "3" 表示M.kyonggiensisKACC17471T;"4" 表示M.niastensisKACC12599T;"5" 表 示M.tieshanensisKACC14940T;"6" 表示M.haematophilaCCUG38318T;"7" 表示 M.namucuoensisCGMCC1.11014T;"8" 表示M.aerilataKACC12505 T.
[0035]注 2:"Summedfeature3"表示C16:1 〇7c和 / 或C16:1 〇6c;"ND"表示未檢測到 該組分；"〈1"表示該組份含量小于脂肪酸總體含量的1% ;
[0036] 綜合表型特征、遺傳發(fā)育分析、化學(xué)分類特征，本發(fā)明的菌株6NM-7是馬賽菌屬的 一個新物種，將其命名為惡臭馬賽菌（Massiliaputida)6NM-7,已于2015年7月14日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址：中國北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo: 11070。
[0037] 三、惡臭馬賽菌6NM-7產(chǎn)二甲基二硫醚（DMDS)的測定：
[0038] 挑取本發(fā)明的惡臭馬賽菌6NM-7的單菌落，接種至200mL的液體R2A培養(yǎng)基中， 180rpm搖床30°C振蕩培養(yǎng)3天。采用一次性注射器吸取三角瓶中的惡臭氣體，通過氣相色 譜質(zhì)譜儀（GC-MS)進(jìn)行分析。測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥氣味的惡臭氣體主要成分為二甲基二硫醚 (DMDS)，如圖3所示。圖3A為惡臭氣體的GC分析，在4. 6min和6. 8min分別產(chǎn)生了兩個峰。 圖3B為4. 6min的組份經(jīng)過質(zhì)譜分析為二甲基二硫醚（DMDS)。6. 8min為柱流失成分。
[0039] 由于二甲基二硫醚是一種極為重要的新型土壤熏蒸劑，本發(fā)明提供的產(chǎn)二甲基二 硫醚（DMDS)的惡臭馬賽菌6NM-7在防治土傳病害和研發(fā)新型土壤熏蒸劑上具有重要的應(yīng) 用價值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1?惡臭馬賽菌（Massilia putida)6NM-7,保藏編號為 CGMCC No:11070。2. 權(quán)利要求1所述的惡臭馬賽菌（Massilia putida)6NM_7在制備二甲基二硫醚中的 應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的惡臭馬賽菌（Massilia putida)6NM-7在制備土壤熏蒸劑中的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種惡臭馬賽菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的惡臭馬賽菌(Massilia？putida)6NM-7是一個微生物新物種，已于2015年7月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC？No:11070。其能產(chǎn)二甲基二硫醚(DMDS)，在防治土傳病害和研發(fā)新型土壤熏蒸劑上具有重要的應(yīng)用價值。CGMCC No:1107020150714
【IPC分類】A01N25/18, A01P1/00, C12N1/20, C12R1/01, A01N63/00, A01P3/00, C12P11/00
【公開號】CN105112324
【申請?zhí)枴緾N201510497964
【發(fā)明人】馮廣達(dá), 朱紅惠, 羊宋貞, 王永紅, 李燕旋, 楊瑞恒
【申請人】廣東省微生物研究所
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月14日