免疫細(xì)胞培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DC-CIK共免疫中，DC (dendritic cell，樹突狀細(xì)胞)主要是從骨髓組織、血液中分離出的具有很強(qiáng)的捕獲抗原、呈遞抗原的能力和分泌能力，能夠誘導(dǎo)持久有力的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)；而011((細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞)是人外周血中單個核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。它具有增殖能力強(qiáng)、殺瘤活性高和殺瘤譜廣、臨床應(yīng)用不良反應(yīng)小的特點(diǎn)，是腫瘤過繼免疫治療中更為有效的殺瘤效應(yīng)細(xì)胞。DC-CIK聯(lián)合免疫中，將DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，使兩者之間相互既促進(jìn)DC的成熟，更能促進(jìn)ClK的增殖并且加強(qiáng)CIK的腫瘤殺傷效力。
[0003]然而在上述DC與CIK的共培養(yǎng)中，由于DC本身分離自單個核細(xì)胞(PBMC)體外培養(yǎng)中的半貼壁細(xì)胞。目前進(jìn)行共培養(yǎng)時，都是將DC直接貼附在培養(yǎng)容器上，培養(yǎng)容器的生長氛圍不如原始生存環(huán)境，導(dǎo)致DC的生長、成熟以及表達(dá)的性狀、免疫活性等方面都不能達(dá)到原始體內(nèi)環(huán)境的水平，大大影響了 DC所要具備的抗原提呈效果。而由于CIK功能的強(qiáng)弱與DC的細(xì)胞密度以及其提呈的專一性有關(guān)，DC體外增殖能力低、相反CIK競爭性增殖能力強(qiáng)大，會造成DC不足引起與CIK的接觸機(jī)會低，從而使得DC的抗原提呈作用無法發(fā)揮，從而降低CIK的治療效力。
[0004]因此，在上述培養(yǎng)環(huán)境不能滿足DC培養(yǎng)體外增殖的情形下，通常技術(shù)人員在培養(yǎng)中借用培養(yǎng)通常細(xì)胞的中空纖維培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)以及微囊培養(yǎng)法等提升培養(yǎng)的環(huán)境，以彌補(bǔ)簡單液體培養(yǎng)瓶的不足；但是，DC這一類的單核貼壁細(xì)胞貼壁的容器壁面形狀迥異于人體內(nèi)的微環(huán)境，在培養(yǎng)的過程中細(xì)胞體自身也容易受剪切力的損傷；更主要地，細(xì)胞的生長方向多趨于二維，導(dǎo)致采用上述培養(yǎng)方式DC細(xì)胞與抗原接觸機(jī)會仍然不足，細(xì)胞品質(zhì)仍然無法達(dá)到較好的預(yù)期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明實(shí)施的目的在于克服上述體外培養(yǎng)中常規(guī)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)環(huán)境的不足，提供一種采用3D膠原蛋白細(xì)胞培養(yǎng)支架的培養(yǎng)容器進(jìn)行DC和CIK免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下:
[0007]—種免疫細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0008]獲取DC 和 CIK ；
[0009]制備具有3D膠原蛋白細(xì)胞培養(yǎng)支架的培養(yǎng)容器；
[0010]將DC接種所述培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)，并在DC培養(yǎng)的過程中用誘導(dǎo)活化劑進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng);
[0011]用誘導(dǎo)培養(yǎng)后的DC于所述培養(yǎng)容器中與CIK進(jìn)行共培養(yǎng)。
[0012]本發(fā)明的上述方法步驟，將其中的培養(yǎng)容器改為具有3D膠原蛋白細(xì)胞培養(yǎng)支架的培養(yǎng)容器，通過該支架自身具有的多孔隙的微孔環(huán)境，并且自身具有良好的復(fù)水性和細(xì)胞親和性能，能保持或者吸收養(yǎng)料形成細(xì)胞培養(yǎng)的料床，提供相比其他支架更好的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，提升了細(xì)胞生長和增殖的能力；同時在DC和CIK共培養(yǎng)的過程中，孔隙內(nèi)細(xì)胞的保持能力在局部上可以提升DC和CIK的接觸幾率，提升DC和CIK培養(yǎng)的細(xì)胞活性和品質(zhì)。
【具體實(shí)施方式】
[0013]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0014]本發(fā)明實(shí)施例提出一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0015]S10，獲取 DC;
[0016]S20，制備具有3D膠原蛋白細(xì)胞培養(yǎng)支架的培養(yǎng)容器；
[0017]S30，將DC接種至步驟S20的培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0018]S40，在步驟S30進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)的過程中，用誘導(dǎo)活化劑對DC進(jìn)行誘導(dǎo)；
[0019]S50，向步驟S40誘導(dǎo)后的培養(yǎng)容器中加入CIK，進(jìn)行DC-CIK共培養(yǎng)。
[0020]本發(fā)明的上述方法步驟，針對現(xiàn)有通常DC和CIK培養(yǎng)的方法的，將其中的培養(yǎng)容器改為具有3D膠原蛋白細(xì)胞培養(yǎng)支架的培養(yǎng)容器，通過該支架自身具有的多孔隙的微孔環(huán)境，并且自身具有良好的復(fù)水性和細(xì)胞親和性能，能保持或者吸收養(yǎng)料形成細(xì)胞培養(yǎng)的料床，提供相比其他支架更好的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，提升了細(xì)胞生長和增殖的能力；同時在DC和CIK共培養(yǎng)的過程中，孔隙內(nèi)細(xì)胞的保持能力在局部上可以提升DC和CIK的接觸幾率，提升DC和CIK培養(yǎng)的細(xì)胞活性和品質(zhì)。
[0021]具體本發(fā)明的上述步驟實(shí)施中，步驟SlO獲取的用來進(jìn)行免疫培養(yǎng)的DC和CIK可以用新鮮的臍帶血自行制備，或者直接購買都可以。然后進(jìn)行免疫培養(yǎng)，重點(diǎn)在步驟S20中所制備的具有支架的容器，其中3D膠原蛋白細(xì)胞培養(yǎng)支架并不是市售的產(chǎn)品，需要自行制備，具體的步驟可以參考如下進(jìn)行:
[0022]S21，將膠原蛋白溶解在0.03?0.06mol/L的醋酸溶液中，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)I?2%的膠原溶液；
[0023]S22，將膠原溶液于模具中冷凍成型，得到膠原塊；
[0024]S23，將膠原塊進(jìn)行真空干燥，得到膠原海綿體；
[0025]S24，將膠原海綿體于100?110°C下進(jìn)行真空熱交聯(lián)，即得到膠原支架；
[0026]S25，將步驟S24制備得到的膠原支架于細(xì)胞培養(yǎng)容器的內(nèi)壁面上進(jìn)行固定。
[0027]首先，上述步驟S21中首先將原料膠原蛋白溶解制成溶液，是為了在制備溶液的過程中能夠使膠原蛋白的蛋白纖維重新分布，保證重新成型后的固態(tài)形狀的品質(zhì)；雖然本發(fā)明在3D支架的早期制備中采用直接將膠原蛋白采用冷凍抽干直接固化成型，也可得到組織工程載體；但是這樣的方式得到的載體之后進(jìn)行細(xì)微的電鏡掃描觀察，其微觀結(jié)構(gòu)紊亂且整體并不穩(wěn)定，內(nèi)部蛋白纖維連接并不穩(wěn)定，往往在DC還未培養(yǎng)至成熟就已經(jīng)分解破碎。而細(xì)胞培養(yǎng)中如果支架的孔隙過大，那么細(xì)胞無法良好地貼服，如果孔隙小，那么細(xì)胞短短幾次分裂之后會因?yàn)榭臻g、養(yǎng)料的不足而死亡；所以本發(fā)明中用溶解之后使其纖維均一形成溶液，避免直接抽干之后孔隙不均一的缺陷。并且，上述膠原支架的原料膠原蛋白本身可以直接去購買或者自行制備，本發(fā)明步驟S21中所采用的膠原蛋白最好采用成纖維膠原蛋白，主要一方面是來源廣，包括第I型膠原、II型膠原、III型膠原、XI型膠原、XXIV型膠原和XXVII型膠原，約占膠原總數(shù)的90%。相比成纖維膠原，非成纖維膠原的α -鏈既含有三螺旋域(膠原域，COL)，還含有非三螺旋域(非膠原域，NC)，結(jié)構(gòu)上不利于交聯(lián)形成孔隙均一和穩(wěn)定的支架。
[0028]進(jìn)一步在步驟S22中將膠原溶液于模具中冷凍成型，得到膠原塊；而在該步驟中，基于本發(fā)明中膠原蛋白濃度和冷凍的要求，采用冷凍過程控制-20?30°C左右I?2h即可。采用凍干的方式得到固化的膠原蛋白，一方面可以初步形成支架的雛形，另一目的在于維持后續(xù)交聯(lián)的過程中蛋白分子不至于沉降、聚集等等。其中，需要指出的是該模具的采用是基于支架成型的形狀進(jìn)行的采用，根據(jù)所需填充的培養(yǎng)容器的大小或者不同培養(yǎng)容器的形狀，模具也可以進(jìn)行相應(yīng)的改變，或者可以自行設(shè)計均可。冷凍成型的過程中，一般控制時間I?2h即可，避免溫度進(jìn)一步過低下進(jìn)行凍干生成冰晶的剪切力過大對蛋白纖維造成更加驗(yàn)證的變性傷害。
[0029]在固化成塊狀之后步驟S23中將固化后形成的膠原塊進(jìn)行真空干燥，得到膠原海綿體。在該步驟中通過真空將凍結(jié)的膠原塊中的冰晶直接進(jìn)行升華從而去除，在真空條件下進(jìn)行干燥的過程，可以保持生物活性，尤其是避免熱敏和氧化等情形使其被破壞。并且在真空凍結(jié)中進(jìn)行升華干燥之后，能形成“骨架”，干燥后能保持原形，體積幾乎不變。凍干之后形成的海綿體，復(fù)水性好，可迅速溪水還原成凍干前的狀態(tài)。這一復(fù)水性的海綿特性能使支架之后被用于液體培養(yǎng)基的過程時，自身能吸收很多液體培養(yǎng)基中的養(yǎng)料成分，之后支架自身便可以作為細(xì)胞的料床，為細(xì)胞的生長提供較為全面的三維環(huán)境，而不僅僅只是簡單的粘附。
[0030]而進(jìn)一步出于品質(zhì)的效果，由于上述步驟S24中需要對蛋白纖維的交聯(lián)度和干化的程度進(jìn)行掌控，而影響熱交聯(lián)處理中這一效果的，還有步驟S23中將將膠原塊進(jìn)行真空干燥得到膠原海綿體步驟中，真空干燥的程度?；谶@一目的，本發(fā)明中步驟S23的干燥時間控制36?48h，使干燥的過程冷凍干燥程度即可，而不進(jìn)行到解析干燥的步驟。采用冷凍干燥36?48h將其中的冰升華為水蒸氣的升華干燥(非解析干燥)方式，這一過程能除去的是膠原塊中原本溶液中的大量的自由水分子，而不會去除與蛋白分子吸附的結(jié)合水；保留這些