一種多酶耦聯(lián)體系制備手性胺的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多酶耦聯(lián)體系制備手性胺的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性胺是許多生物活性分子的結(jié)構(gòu)單元，是合成天然產(chǎn)物和手性藥物的重要中間 體。約40%的光學(xué)活性藥物含有手性胺單元。同時(shí)，手性胺可以為用作為拆分劑、手性助劑 和手性合成物，在精細(xì)化工、制藥和農(nóng)用化學(xué)品中得到廣泛的應(yīng)用。當(dāng)前，在化工和制藥產(chǎn) 業(yè)中生物催化法制備手性化合物應(yīng)用廣泛，具有廣闊前景。胺脫氫酶催化酮和氨基供體不 對(duì)稱還原胺化制備手性胺是簡(jiǎn)潔高效的反應(yīng)路徑。
[0003]胺脫氫酶在催化反應(yīng)過(guò)程中需要輔酶作為電子傳遞體。然而，由于輔酶價(jià)格昂貴， 對(duì)于面向工業(yè)應(yīng)用的生物催化，為提高反應(yīng)催化效率和經(jīng)濟(jì)性，需要構(gòu)建輔酶循環(huán)體系。體 外多酶耦聯(lián)實(shí)現(xiàn)輔酶再生體系不乏工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)例。利用L-亮氨酸脫氫酶與甲酸脫 氫酶的耦聯(lián)體系催化制備酮異己酸，該體系可連續(xù)催化48天，最高轉(zhuǎn)化率達(dá)99. 7%，生產(chǎn) 能力為42. 5g/L/day，在德國(guó)DegussaAG實(shí)現(xiàn)噸級(jí)規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。Ronald等人采用 Thermoactnomycesintermedius所產(chǎn)生的高活性苯丙氨酸脫氫酶與Candidaboidinii中 的甲酸脫氫酶組成耦聯(lián)反應(yīng)體系，L-苯丙氨酸產(chǎn)率達(dá)到84%。Karsten構(gòu)建了一種新型的 以NADP+作為輔酶的甲酸脫氫酶，與乳酸桿菌中的乙醇脫氫酶構(gòu)建了NADPH再生耦聯(lián)系統(tǒng)。 然而，利用胺脫氫酶與其他依賴NADH的氧化還原酶構(gòu)建多酶耦聯(lián)體系催化制備手性胺并 實(shí)現(xiàn)輔酶再生還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明構(gòu)建了多種多酶耦聯(lián)體系，催化制備手性胺并實(shí)現(xiàn)輔酶的循環(huán)再生。同時(shí) 考察了耦聯(lián)體系的組成、反應(yīng)條件對(duì)催化效率的影響。該發(fā)現(xiàn)所獲得的耦聯(lián)體系具有簡(jiǎn)單 高效等優(yōu)點(diǎn)，并實(shí)現(xiàn)了輔酶的循環(huán)再生，促進(jìn)不對(duì)稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，降低成本，提高 胺脫氫酶制備手性胺的效率。
[0005]所述的多酶耦聯(lián)體系制備手性胺的方法，包括以下步驟：
[0006] 1)催化不對(duì)稱合成手性胺的胺脫氫酶的制備：構(gòu)建如SEQ ID NO. 1所示的胺脫氫 酶基因；利用上述基因制備可表達(dá)胺脫氫酶的工程菌；將上述工程菌接種，加入誘導(dǎo)劑，培 養(yǎng)所得發(fā)酵液離心獲得細(xì)胞；細(xì)胞超聲破碎，離心，得到含有胺脫氫酶的粗酶液；將上述含 有胺脫氫酶的粗酶液進(jìn)行純化除鹽，得到胺脫氫酶；
[0007] 2)輔酶再生酶的制備：分別構(gòu)建如SEQIDN0. 2所示的甘油脫氫酶基因和如SEQ IDN0. 3所示的甲酸脫氫酶基因；利用上述基因分別制備可表達(dá)甘油脫氫酶的工程菌和可 表達(dá)甲酸脫氫酶的工程菌；將上述工程菌分別接種，加入誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)所得發(fā)酵液離心獲得 細(xì)胞；細(xì)胞超聲破碎，離心，得到含有甘油脫氫酶的粗酶液和含有甲酸脫氫酶的粗酶液；將 上述兩種粗酶液分別進(jìn)行純化除鹽，得到兩種輔酶再生酶即甘油脫氫酶和甲酸脫氫酶；
[0008] 3)利用胺脫氫酶與輔酶再生酶構(gòu)建多酶耦聯(lián)體系：
[0009] (3a)胺脫氫酶-甘油脫氫酶耦聯(lián)體系：將甘油與氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+)溶于氯化銨-氨水緩沖液中，甘油的加入量為0? 5~5M，氧化型煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸（NAD+)的添加量為為0. 2~20mM，加入胺脫氫酶與甘油脫氫酶，得到胺脫氫酶-甘油 脫氫酶耦聯(lián)體系；或，
[0010] (3b)胺脫氫酶-甲酸脫氫酶耦聯(lián)體系：將甲酸鈉和NAD+溶于氯化銨-氨水緩沖液 中，甲酸鈉的加入量為20~500mM，NAD+的添加量為為0. 2~20mM，加入胺脫氫酶與甲酸脫 氫酶，得到胺脫氫酶-甲酸脫氫酶耦聯(lián)體系；或，
[0011] (3c)胺脫氫酶-甘油脫氫酶-甲酸脫氫酶耦聯(lián)體系：將甘油、甲酸鈉和NAD+溶于 氯化銨-氨水緩沖液中，甘油的加入量為〇. 5~5M，甲酸鈉的加入量為20~500mM，NAD+的 添加量為〇. 2~20mM，加入胺脫氫酶、甘油脫氫酶與甲酸脫氫酶，得到胺脫氫酶-甘油脫氫 酶-甲酸脫氫酶耦聯(lián)體系；
[0012] 4)利用步驟3)所配置的多酶耦聯(lián)體系催化制備手性胺：將底物酮溶于少量異丙 醇，加到步驟（3a)~（3c)中得到的任一種多酶耦聯(lián)體系中，用氨水調(diào)節(jié)體系的pH值為8~ 11，底物酮的加入量為20~500mM;利用所述多酶耦聯(lián)體系對(duì)底物酮進(jìn)行催化反應(yīng)，即得手 性胺。
[0013] -實(shí)施例中：所述步驟1)中，胺脫氫酶基因序列來(lái)源于Bacillusbadius，所述可 表達(dá)胺脫氫酶的工程菌為重組大腸桿菌E.coliBL21 (DE3) -adh。
[0014] 一實(shí)施例中：所述步驟2)中，甘油脫氫酶基因序列來(lái)源于Klebsiella pneumoniae，所述可表達(dá)甘油脫氫酶的工程菌為重組大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)-gldA;
[0015] -實(shí)施例中：所述步驟2)中，甲酸脫氫酶基因序列來(lái)源于Candidaboidinii，所 述可表達(dá)甲酸脫氫酶的工程菌為E.coliBL21 (DE3)-fdh。
[0016] -實(shí)施例中：所述步驟3)中，加入胺脫氫酶并使其終濃度為20~200U/L，加入甘 油脫氫酶并使其終濃度為50~150U/L，加入甲酸脫氫酶并使其終濃度為50~150U/L;加 入的胺脫氫酶和/或甘油脫氫酶和/或甲酸脫氫酶均為溶解在濃度20~100mM，pH7. 0的 磷酸鹽緩沖液中的酶液。
[0017] -實(shí)施例中：所述步驟3)中，氯化銨-氨水緩沖液為反應(yīng)體系中的氨基供體，其濃 度為200~500mM，用氨水調(diào)節(jié)pH值為8~11。
[0018] -實(shí)施例中：所述步驟4)中，底物為苯氧基-2丙酮、4-甲基-2-戊酮、苯乙酮、 5-甲基-2-己酮、丁酮中的一種。
[0019] -實(shí)施例中：所述步驟4)中，催化反應(yīng)條件如下：在4~60°C，100~300rpm下反 應(yīng)6~48小時(shí)。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種多酶耦聯(lián)體系的制備方法，參照上述步驟1)~3)。
[0021] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0022] 構(gòu)建多種多酶耦聯(lián)體系不對(duì)稱還原底物酮獲得產(chǎn)物手性胺，并通過(guò)在胺脫氫酶催 化不對(duì)稱合成手性胺的體系中添加使輔酶NAD+再生成NADH的氧化還原酶及其輔助底物。 通過(guò)構(gòu)建多酶耦聯(lián)體系，實(shí)現(xiàn)了輔酶的再生循環(huán)，較好地解決了胺脫氫酶生物催化反應(yīng)過(guò) 程中的輔酶再生問(wèn)題，提高了輔酶的利用效率，促進(jìn)不對(duì)稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，提高胺脫 氫酶制備手性胺的效率，降低了生產(chǎn)成本。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0024] 圖1為苯氧基-2-丙酮、R-苯氧基-2-丙胺、S-苯氧基-2-丙胺標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液 相色譜圖，苯氧基-2-丙酮的保留時(shí)間為6. 435min，R-苯氧基-2-丙胺和S-苯氧基-2-丙 胺的保留時(shí)間分別為7. 24min和8. 681min。
[0025]圖2為實(shí)驗(yàn)例一產(chǎn)物R-苯氧基-2-丙胺的高效液相色譜圖。
[0026] 圖3為實(shí)施例四的4-甲基-2-戊酮和R/S-4-甲基-2-戊胺的氣相色譜圖，4-甲 基-2-戊酮保留時(shí)間為6. 157min，S-4-甲基-2-戊酮和R-4-甲基-2-戊酮的保留時(shí)間分 別為 11. 533min和 11. 637min。
[0027] 圖4為實(shí)施例五的5-甲基-2-己酮和S/R-5-甲基-2-己胺的氣相色譜圖，5-甲 基-2-己酮的保留時(shí)間為8. 658min，S-5-甲基-2-己胺和R-5-甲基-2-己胺的保留時(shí)間 分別為 14. 529min和 14. 665min。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面通過(guò)實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容：
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 1)胺脫氫酶的制備：
[0031] 菌株構(gòu)建、培養(yǎng)與收集：構(gòu)建如SEQ ID NO. 1所示的胺脫氫酶基因，胺脫氫酶基因 序列來(lái)源于Bacillusbadius，利用上述胺脫氫酶基因制備可表達(dá)胺脫氫酶的工程菌重組大 腸桿菌E. coli BL21(DE3)-adh ;以1%的接種量，將上述工程菌接入200mL LB培養(yǎng)基中，接 種前添加卡那霉素使其終濃度為40 y g/mL。37°C、轉(zhuǎn)速200rpm培養(yǎng)時(shí)間6小時(shí)。加入誘導(dǎo) 劑IPTG，使其終濃度為10mg/ml，繼續(xù)在30°C、200rpm條件下培養(yǎng)4小時(shí)。
[0032] 粗酶液制備：培養(yǎng)結(jié)束所得的發(fā)酵液，在冷凍離心機(jī)中離心（4°C，SOOOrpm， 15min)獲得細(xì)胞，棄上清液，沉淀用Tris-HCl緩沖液（pH7. 5)重懸，充分洗滌后離心，重復(fù) 操作3次獲得細(xì)胞。利用超聲破碎儀對(duì)細(xì)胞液進(jìn)行處理，然后4°C、12,OOOrpm離心15min 去除不溶性細(xì)胞碎片，上清即為含有胺脫氫酶的粗酶液。
[0033] 純酶制備：采用GE公司（General Electric Company)的His Trap鎳柱對(duì)上述含 有胺脫氫酶的粗酶液進(jìn)行分離純化，并用PALL公司（Pall Corporation)的10K的超濾離 心管進(jìn)行超濾除鹽，得到胺脫氫酶。
[0034] 2)輔酶再生酶的制備：
[0035] 甘油脫氫酶：
[0036] 菌株構(gòu)建、培養(yǎng)與收集：構(gòu)建如SEQIDN0.2所示的甘油脫氫酶基因，甘油脫氫酶 基因序列來(lái)源于Klebsiellapneumoniae，利用上述甘油脫氫酶基因制備可表達(dá)甘油脫氫 酶的工程菌重組大腸桿菌E.coli